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Apr 26, 2023

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Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 164 (2023) Citar este artículo

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Los organoides retinianos tridimensionales (retinas 3D) son una fuente de injerto prometedora para la terapia de trasplante. Anteriormente, desarrollamos un cultivo autoorganizado para la generación de retina 3D a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC). Aquí presentamos un método de control de calidad y estudios preclínicos para el trasplante de hojas de tejido. Las hPSC autoorganizadas se diferenciaron en tejidos retinianos y fuera del objetivo. Los análisis de expresión génica identificaron los principales tejidos fuera del objetivo como tejidos relacionados con los ojos, similares a la corteza y similares a la médula espinal. Para el control de calidad, desarrollamos una prueba basada en qPCR en la que cada neuroepitelio derivado de hPSC se diseccionó en dos hojas de tejido: hoja central interna para trasplante y hoja periférica externa para qPCR para garantizar la selección de tejido retiniano. Durante la qPCR, las láminas de tejido se almacenaron durante 3 a 4 días utilizando un método de conservación recientemente desarrollado. En un estudio de tumorigenicidad en ratas, no se observaron eventos adversos relacionados con el trasplante. En ratas modelo de degeneración retinal, los trasplantes de retina se diferenciaron en fotorreceptores maduros y exhibieron respuestas a la luz en ensayos de electrofisiología. Estos resultados demuestran nuestro fundamento hacia la terapia de trasplante de lámina de retina autoorganizada.

Las células madre pluripotentes (PSC) tienen la capacidad de autoorganizarse en tejido neural tridimensional (3D)1. Los agregados autoorganizados con tejido 3D se denominan organoides y representan fuentes de injerto prometedoras para la terapia de trasplante de células/tejidos. Hacia la terapia de trasplante de retina humana, se han desarrollado varios métodos de diferenciación de retina2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Entre ellos, una tecnología de cultivo de células madre autoorganizadas, SFEBq (cultivo flotante libre de suero de agregados similares a cuerpos embrioides con agregación rápida), es útil para la generación de retina 3D5,6,7,8,15,17. Previamente modificamos el método SFEBq mediante el tratamiento con proteína morfogenética ósea (BMP) cronometrada para generar retinas 3D a partir de células madre embrionarias humanas (ESC) libres de alimentador y células madre pluripotentes inducidas (iPSC)7,8. Las retinas 3D en este sistema de cultivo contienen progenitores retinales neurales (retinales) que se expanden para dar lugar a fotorreceptores y otras neuronas retinales y forman un tejido retinal estratificado de varias capas de manera dependiente de la etapa, recapitulando el desarrollo in vivo.

La retinitis pigmentosa es un grupo de enfermedades hereditarias caracterizadas por la pérdida progresiva de fotorreceptores de bastones seguidos de fotorreceptores de conos, y es la principal causa de ceguera en los países desarrollados. El trasplante de fotorreceptores y/o progenitores retinianos es una opción terapéutica prometedora23,24,25,26. De hecho, el trasplante de tejidos y células de la retina de tejidos embrionarios primarios tenía el potencial de mejorar la función visual23,27,28,29, aunque las contribuciones del injerto de tejido/célula y la transferencia de material donante-huésped quedan por estudiar30. Para suministrar cantidades adecuadas de tejidos y células retinales para la terapia celular, las retinas 3D generadas a partir de PSC representan una fuente de injerto prometedora. Los precursores de fotorreceptores purificados a partir de retinas derivadas de PSC pueden sobrevivir, hacer contacto con la retina huésped y mejorar la función visual10,17,18,26,31,32. Las láminas de tejido retiniano humano y de ratón (láminas retinianas de ahora en adelante) diseccionadas de retinas 3D se injertaron en ratones y ratas modelo de degeneración retiniana en etapa terminal y exhibieron una maduración funcional que resultó en la restauración de las respuestas a la luz33,34,35,36,37. Además, las retinas 3D derivadas de hPSC tenían baja inmunogenicidad y propiedades inmunosupresoras38. El trasplante de láminas de PSC-retina humana en modelos de degeneración retiniana de primates mostró un injerto a largo plazo durante 2 años36,39. Estos estudios preclínicos de trasplante indican que las láminas de retina derivadas de PSC alogénicas tienen el potencial de mejorar la función visual.

Hacia las aplicaciones clínicas en láminas de retina derivadas de PSC, el establecimiento de una estrategia de control de calidad (QC) para retinas 3D (productos intermedios) y láminas de retina disecadas (productos finales) sigue siendo un gran desafío. Se ha mejorado el cultivo de autoorganización para reducir la variación en los organoides tanto a nivel intralote como entre lotes. Eiraku y sus colegas desarrollaron el método SFEBq para regular el tamaño y la calidad de los agregados derivados de PSC5,40. Desarrollamos un sistema de cultivo modificado para reducir la variedad de la calidad de los organoides, como las morfologías de los organoides y las proporciones de la retina neural (retina) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE)7,8, aunque los organoides individuales todavía exhiben diversas morfologías 3D y múltiples off- tejidos diana. Algunos tejidos fuera del objetivo se identificaron como tejido RPE y tejido similar a la corteza7,12. Nuestros estudios de trasplante anteriores utilizaron líneas de PSC que albergaban líneas de reportero knock-in de proteína fluorescente para Rx (también llamado Rax) y Crx para etiquetar las células de la retina adecuadas para el trasplante6,35,39. Sin embargo, las líneas indicadoras de activación de proteínas fluorescentes xenogénicas no son ideales para aplicaciones clínicas. Aquí establecemos una nueva estrategia de control de calidad para seleccionar tejido retiniano en los organoides. Luego realizamos estudios preclínicos de seguridad y eficacia para demostrar la justificación de la terapia de trasplante alogénico de láminas de retina.

Hacia la terapia de trasplante de tejido retiniano, desarrollamos un método sólido de diferenciación retiniana que consta de cinco procesos basados ​​en estudios previos:5,6,7,8,33,39 (1) cultivo de mantenimiento con cultivo de hPSC sin alimentador y métodos de preacondicionamiento, ( 2) diferenciación retiniana con métodos SFEBq y BMP, (3) cultivo de inducción-reversión, (4) cultivo de maduración y (5) disección (Fig. 1a).

un Esquema de la cultura autoorganizada. b Vista de campo brillante del agregado celular derivado de iPSC-S17 que contiene tejido retiniano los días 14, 42, 91 y 180 (superior). Barra de escala en vista de campo claro: 100 µm. Inmunotinción de tejido retiniano derivado de iPSC-S17 los días 14, 42, 91 y 180 (medio e inferior). Crx (verde) y Chx10 (rojo) en paneles intermedios. Pax6 (verde) y Recoverin (rojo) en paneles inferiores. Azul: tinción nuclear con DAPI. Barra de escala en inmunotinción: 20 µm. c Inmunotinción de tejido retiniano derivado de iPSC-S17 el día 180. RXRG (verde) y NRL (rojo) en el panel superior izquierdo. Lhx2 (rojo) en el panel superior derecho. CtBP2 (verde) y Recoverin (rojo) en el panel inferior izquierdo. Cone-arrestin (verde) en el panel inferior derecho. Azul: tinción nuclear con DAPI. Barra de escala: 20 µm. d Análisis de expresión génica en agregados de células derivadas de iPSC-S17 que contienen tejido retiniano los días 0, 6, 14, 45, 60 y 80. En cada réplica, se extrajo ARN de 48 agregados. Los niveles de ARNm se determinaron mediante análisis qPCR. La expresión relativa de ARNm se determinó mediante el método delta-delta Ct con GAPDH como control endógeno. Los datos se presentan como media ± SE (n = 4 por punto de tiempo). e Vista de campo brillante de la hoja de retina derivada de iPSC-S17. Barra de escala: 100 µm. f Inmunotinción de la hoja de retina derivada de iPSC-S17 el día 87. Crx (verde) y Chx10 (rojo) en el panel izquierdo. Rx (verde) y Recoverin (rojo) en el panel derecho. Azul: tinción nuclear con DAPI. Barra de escala: 100 µm.

En el Proceso 1, las líneas celulares iPSC humanas se mantuvieron en matriz LM511-E8 en medio StemFit41,42. Cuatro líneas de células iPSC, iPSC-S17, iPSC-LPF11, iPSC-1231A3 e iPSC-QHJI01s04 (iPSC-Q), se expandieron de forma estable en este cultivo de mantenimiento sin alimentador y su tiempo de duplicación fue de aproximadamente 12 a 18 h. Las iPSC se preacondicionaron con SB431542 (SB; inhibidor de la señalización de TGF-beta/Nodal/Activin) más agonista suavizado (SAG; agonista de la señalización de Shh) durante 18 a 30 h antes de la diferenciación (SB + SAG en lo sucesivo)8. En el Proceso 2, se llevó a cabo un cultivo de diferenciación retinal 3D utilizando el método SFEBq-BMP. Las iPSC se disociaron en células individuales, se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V y se cultivaron en medio de diferenciación (CDM sin factor de crecimiento [gfCDM] + reemplazo de suero Knockout [KSR]) en presencia de Y-27632 y SAG8. Los agregados de iPSC resultantes se trataron con BMP4 el día 3 y se cultivaron en medio gfCDM+KSR7. El día 14, los agregados de iPSC se fijaron y se inmunoteñeron para los marcadores progenitores retinianos Pax6 y Chx10 (también llamados Vsx2). Se encontró que los agregados de iPSC contenían un neuroepitelio en su superficie, y la mayoría de las células en el neuroepitelio fueron positivas para Chx10 y Pax6, lo que indica que las iPSC formaron tejido retiniano inmaduro (Fig. 1b). En el Proceso 3, el tejido retiniano inmaduro se cultivó mediante un método de cultivo de inversión por inducción para regular con precisión las proporciones de retina neural (retina) y RPE7. El tejido retiniano inmaduro se cultivó con CHIR99021 (CHIR; agonista de Wnt) y SU5402 (SU; inhibidor de FGFR) durante 3 días para sesgar las células hacia el destino RPE y luego se cultivó más en medio de maduración de retina que contenía suero y taurina durante 23 días para obtener un intermedio de inducción-reversión. En el Proceso 4, el intermedio de inducción-reversión se cultivó adicionalmente en un medio de maduración de retina que contenía suero, taurina y T3 durante 20 a 60 días para obtener la retina 3D. En los días 60 a 100, la retina 3D se fijó e inmunotiñó para Chx10, Pax6, Crx (marcador precursor de fotorreceptores) y Recoverin (marcador de fotorreceptores). Se descubrió que la retina 3D contenía un tejido retiniano multicapa, que comprende una capa precursora de fotorreceptores con células Crx+ y Recoverin+ en la superficie exterior, una capa progenitora retiniana con células Chx10+/Pax6+ en el medio y una capa neuronal con Chx10−/Pax6++ células y células Crx+ y Recoverin+ en el lado interior (Fig. 1b y Fig. 1a, b, c complementarias).

Además, cultivamos retinas 3D en un medio de maduración a largo plazo que contenía ácido retinoico todo trans para examinar la expresión de los marcadores de maduración de la retina. Se confirmó que las retinas 3D en el día 180 contenían un tejido retinal multicapa con capas de fotorreceptores y progenitores retinales (Fig. 1b, c). Se encontraron células NRL+, RXRG+ y Cone-arrestin+ en la capa externa de fotorreceptores de la retina 3D, lo que indica la diferenciación en precursores de varilla y precursores de cono (Fig. 1c). La capa neuronal Lhx2+ se encontró en el lado interno de la retina 3D (Fig. 1c). Algunas células Recoverin+ expresaron CtBP2 (también llamado Ribeye), lo que sugiere que los fotorreceptores derivados de iPSC tenían la capacidad de expresar proteínas sinápticas de fotorreceptores (Fig. 1c y Fig. 1d complementaria).

Para analizar la expresión génica, realizamos análisis de qPCR de agregados de iPSC en los días 0, 6, 14, 45, 60 y 80 (Fig. 1d y Fig. 1e complementaria). Los niveles de ARNm de los marcadores progenitores retinianos (Rx, Chx10), los marcadores fotorreceptores (Crx, Recoverin) y un marcador precursor del fotorreceptor cónico (RXRG) aumentaron en los días 6 a 14, en el día 45 y en el día 60, respectivamente. El nivel de ARNm del marcador PSC Oct3/4 disminuyó el día 6. Estos datos son consistentes con estudios previos de cultivo de diferenciación retinal 3D5,6,7,8.

En el Proceso 5, las retinas 3D en los días 60 a 100 se diseccionaron en láminas retinales (productos finales) (Fig. 1e)33,39. Comprobamos la morfología de las láminas retinianas mediante análisis inmunohistoquímico (IHC) y observamos un tejido retiniano continuo multicapa con una capa precursora de fotorreceptores que contenía células Crx+ y Recoverin+ en la superficie exterior y una capa de células progenitoras retinianas con células Chx10+ y Rx+ en la parte interior (Figura 1f). Usando estos cinco procesos, se generaron láminas de retina derivadas de iPSC alogénicas humanas de forma reproducible.

El cultivo autoorganizado imitó el desarrollo embrionario para inducir tejido retinal y tejidos fuera del objetivo. Intentamos identificar los principales tejidos fuera del objetivo en este cultivo en función de la morfología de los agregados. Las células iPSC-LPF11 diferenciadas hacia el destino retinal mediante cultivo autoorganizado se sometieron a análisis de microscopía de campo claro. Descubrimos que las células iPSC-LPF11 se autoorganizaron en tejido retiniano y tres tejidos fuera del objetivo que tenían diferentes morfologías del tejido retiniano (tejido fuera del objetivo-1, -2 y -3) (Fig. 2a). La morfología típica del tejido retiniano era la estructura de neuroepitelio continuo multicapa con una capa exterior brillante y una capa interior marrón (Figs. 1b y 2a). Las morfologías típicas de los tejidos fuera del objetivo eran epitelio arrugado fino pigmentado y/o no pigmentado (tejido fuera del objetivo-1), agregados de células pegajosas con una superficie exterior rugosa (tejido fuera del objetivo-2) y tejido oscuro. agregados coloreados con una parte interna obstruida (tejido fuera del objetivo-3) (Fig. 2a). Diferenciamos tres lotes de cultivo independientes de dos líneas celulares, iPSC-LPF11 e iPSC-S17, y examinamos las proporciones de agregados que contenían tejido retiniano y tejidos fuera del objetivo (Fig. 2b, n = 59–95 agregados por cada lote). Para todos los lotes, la mayoría de los agregados contenían tejido retiniano y la proporción de agregados que contenían tejido fuera del objetivo-1 tendía a ser mayor que la proporción de agregados que contenían tejido fuera del objetivo-2 o tejido fuera del objetivo-3.

una vista de campo brillante del tejido retiniano y tejidos fuera del objetivo en agregados celulares derivados de iPSC-LPF11. Barra de escala: 100 µm. b Proporciones de agregados celulares que contienen tejido retiniano y tejidos fuera del objetivo. Se analizaron tres lotes independientes derivados de células iPSC-LPF11 y tres lotes independientes derivados de células iPSC-S17 (n = 59–95 agregados por cada lote). Los datos se presentan como media ± SE. c Mapa de calor para expresiones génicas en tejido retiniano y tejidos fuera del objetivo derivados de células iPSC-LPF11. Como control, también se muestran las expresiones génicas en células iPSC-LPF11 no diferenciadas. Las expresiones génicas se midieron mediante análisis de qPCR. Se calcularon las puntuaciones Z de fila para cada tejido y se trazaron como un mapa de calor. d Imágenes representativas de campo claro e imágenes IHC para tejidos fuera del objetivo 1 y 2 derivados de células iPSC-LPF11. Las imágenes de campo claro y las imágenes IHC se capturaron en las mismas posiciones. Se muestra la inmunotinción para Aqp1 (arriba a la derecha, rojo) y Emx2 (abajo a la derecha, rojo). Azul: tinción nuclear con DAPI. Barra de escala: 100 µm. e Mapa de calor para expresiones génicas en tejido retiniano y tejido fuera de objetivo-3 derivado de células iPSC-1231A3. Los niveles de ARNm se determinaron mediante análisis de micromatrices. Los valores de LogFC se calcularon para cada gen y se trazaron como un mapa de calor. FC, doble cambio. Tenga en cuenta que el tejido 3 fuera del objetivo expresó genes Hox en comparación con el tejido retiniano.

Para identificar los linajes celulares, se diseccionaron manualmente tejido fuera de objetivo 1, tejido fuera de objetivo 2 y tejido fuera de objetivo 3 derivados de iPSC, posiblemente con pequeñas cantidades de tejidos circundantes, y los niveles de ARNm de genes clave asociados con la elección del destino, la diferenciación y/o el patrón se determinaron mediante análisis de qPCR. En función de los valores de Ct para cada gen, calculamos las puntuaciones Z para cada tejido y las trazamos como un mapa de calor para analizar los patrones de expresión génica en los tejidos (Fig. 2c). Encontramos que el tejido 1 fuera del objetivo expresaba Aqp1 y Mitf, lo que indica que se trataba de tejido relacionado con el ojo con RPE y cuerpo ciliar43,44. El tejido 2 fuera del objetivo expresó Emx2, lo que indica que era un tejido similar a la corteza embrionaria45. El tejido 3 fuera del objetivo mostró una alta expresión del gen homeobox HoxB246,47. El marcador de hPSC indiferenciado Lin28a no se detectó en los tres tejidos fuera del objetivo ni en el tejido retiniano48.

Realizamos análisis IHC y confirmamos que el tejido 1 fuera del objetivo era positivo para RPE y el marcador de cuerpo ciliar Aqp1, mientras que el tejido 2 fuera del objetivo era positivo para el marcador cortical embrionario (telencefálico dorsal) Emx2 (Fig. 2d y Fig. 2a complementaria ). Investigamos la expresión génica en el tejido 3 fuera del objetivo mediante análisis de microarrays y descubrimos que expresaba múltiples genes Hox, incluido HoxB2, lo que indica que era un tejido similar a la médula espinal neural posterior (Fig. 2e). Además, confirmamos que los patrones de expresión génica en los tejidos fuera del objetivo diferían de los de los tejidos de la retina (Fig. 2b complementaria).

Colectivamente, utilizando el método de cultivo autoorganizado, las hPSC se diferenciaron sólidamente para formar un tejido retiniano multicapa y los principales tejidos fuera del objetivo fueron tejido relacionado con el ojo Aqp1+ (tejido fuera del objetivo-1), tejido similar a la corteza Emx2+ (tejido fuera del objetivo -2), y tejido similar a la médula espinal HoxB2+ (tejido fuera del objetivo-3).

El tejido retiniano autoorganizado tenía una estructura única de neuroepitelio continuo multicapa (Figs. 1 y 2). Por lo tanto, podemos identificar el tejido retiniano observando cuidadosamente los agregados bajo un microscopio de campo claro durante la disección (Proceso 5). Sin embargo, las PSC en este cultivo se diferenciaron no solo en tejido retiniano sino también en tejidos fuera del objetivo (Fig. 2), lo que presenta un riesgo potencial de que los tejidos fuera del objetivo se diseccionen para generar el producto final. Hacia las aplicaciones clínicas, nuestro objetivo era desarrollar un método de control de calidad a prueba de fallas para garantizar la selección de láminas de retina trasplantables y evitar incluir tejidos fuera del objetivo por error. Aunque la prueba de control de calidad basada en qPCR para todas las láminas de retina es una forma sensible de detectar tejidos fuera del objetivo, la ejecución de esta prueba conduce a la destrucción de todas las láminas de retina trasplantables. Para evitar esta destrucción, decidimos diseccionar el neuroepitelio continuo en dos hojas de tejido: la hoja central interna para el trasplante (llamada "tapa") y la hoja periférica externa para la prueba de control de calidad (llamada "anillo") (Fig. 3a ). Para estimar la expresión génica de cada hoja central interna (tapa), llevamos a cabo un análisis qPCR de cada hoja periférica externa correspondiente (anillo) (Fig. 3a; prueba de PCR en anillo a continuación).

a Esquema para la disección de la tapa y el anillo y la prueba de PCR en anillo en el Proceso 5 (disección). b Imágenes de campo claro (izquierda) e IHC (centro, derecha) de una tapa y un anillo representativos. La tapa y el anillo se derivaron de células iPSC-LPF11. Se muestra la inmunotinción para Crx (centro, verde), Chx10 (centro, rojo), Pax6 (derecha, verde) y Recoverin (derecha, rojo). DAPI se muestra en azul. Barra de escala: 100 µm. c Mapa de calor para expresiones génicas en capuchones y anillos derivados de células iPSC-LPF11. Como control, también se muestran las expresiones génicas en células iPSC-LPF11 no diferenciadas. Las expresiones génicas se midieron mediante análisis de qPCR. Se calcularon las puntuaciones Z de fila para cada tapa y anillo, y se trazaron como un mapa de calor. d Expresiones génicas representativas en la tapa y el anillo disecados del mismo agregado que se muestran como un gráfico con una línea de regresión (izquierda). Se muestra el coeficiente de determinación (R2) para la expresión génica entre cada capuchón y anillo (derecha). #1–#6 corresponden al Tejido #1–#6 en (c). e Gráficos de violín de datos de PCR de una sola célula obtenidos de una hoja de retina, tejido fuera del objetivo 1, tejido fuera del objetivo 2 e iPSC no diferenciadas. Se muestran las expresiones de genes para células fotorreceptoras (Crx, Recoverin), células progenitoras de la retina (Chx10, Rx, Pax6), otras neuronas de la retina (Pax6, AP2A, STMN2) y tejidos fuera del objetivo (Aqp1, Emx2, HoxB2, Lin28a). .

El neuroepitelio continuo, autoformado en retina 3D derivada de iPSC, se diseccionó en la tapa y el anillo (Fig. 3a, b). Se descubrió que tanto la tapa como el anillo contenían un tejido retiniano continuo de varias capas que comprende una capa precursora de fotorreceptores con células Crx+ y Recoverin+ en la superficie exterior y una capa de células progenitoras de la retina con células Chx10+ y Pax6+ en el lado interior.

Comparamos los patrones de expresión génica en las tapas y los anillos. Se diseccionaron varios neuroepitelios en tejidos de tapa y anillo, y la expresión génica se determinó mediante qPCR (Fig. 3c). Descubrimos que los patrones de expresión génica en cada capuchón y anillo del mismo neuroepitelio eran similares. Para analizar estadísticamente la similitud, dibujamos líneas de regresión para la expresión génica en cada tapa y anillo y calculamos el coeficiente de determinación (R2). Descubrimos que los valores de R2 para todos los juegos de tapa y anillo eran casi 1.0 (Fig. 3d y Fig. 3a, b complementarias). Estos datos indican que los niveles de expresión génica de los genes de la retina y los genes marcadores de tejido fuera del objetivo son casi los mismos entre la tapa y el anillo disecados del mismo agregado.

Luego, realizamos qPCR de cada anillo (Fig. 3a, prueba de ring-PCR). Si un anillo expresa genes retinales y no expresa tanto genes marcadores de tejido fuera del objetivo como el tejido n.° 1 a 6 en la Fig. 3c, se puede seleccionar la tapa correspondiente como hoja retinal (producto final) para el trasplante. Las láminas retinales, derivadas de cuatro líneas iPSC y pasaron la prueba de PCR en anillo, de hecho mostraron patrones de expresión génica retinal similares (Fig. 3c complementaria). Además, realizamos un análisis de PCR de células individuales (scPCR) y descubrimos que la mayoría de las células en las láminas retinianas expresaban Chx10, Crx, Recoverin, Rx, Pax6, AP2A o STMN2 (Fig. 3e).

Estos resultados demostraron que la prueba de PCR en anillo puede estimar la expresión génica en la tapa para seleccionar láminas retinales compuestas por células retinales.

Entre el proceso de disección y el trasplante de láminas de retina, es necesario realizar pruebas de control de calidad, incluida la prueba de PCR en anillo, para seleccionar láminas de retina trasplantables. Sin embargo, se requieren al menos 1 o 2 días para completar la prueba de PCR en anillo. Aunque el tejido retiniano se puede congelar y descongelar como se informó anteriormente6,20, el trasplante subretiniano de tejido retiniano congelado en ratas desnudas mostró un injerto deteriorado. Por lo tanto, nuestro objetivo era desarrollar un método de conservación sin congelación para el tejido retiniano.

En primer lugar, examinamos el medio y la temperatura óptimos para la conservación sin congelación de retinas 3D derivadas de iPSC y láminas de retina disecadas. Para determinar el medio óptimo, evaluamos el medio de maduración retinal, la solución de la Universidad de Wisconsin (UW), la solución salina balanceada (BSS) y Optisol-GS (Optisol en adelante), como soluciones de conservación candidatas49,50,51, a las 4, 17, y 37 °C. Se generaron retinas 3D derivadas de iPSC, se conservaron durante 3 días en diversas condiciones y se cultivaron en medio de maduración retinal a 37 ° C durante 7 días como cultivo de recuperación (Fig. 4a, b). Las retinas conservadas y las retinas de control se fijaron y se inmunoteñeron para comprobar la morfología del tejido retinal. Descubrimos que la conservación a 17 ° C con BSS u Optisol eran las condiciones óptimas para mantener la estructura del epitelio retiniano continuo de múltiples capas (Fig. 4a). La conservación a 4 °C no era una condición preferida, lo que posiblemente provocaba daños en la retina. Tampoco se prefirió la solución UW, un estándar de oro para preservar los tejidos periféricos, incluido el páncreas. Una de las diferencias entre la solución UW y Optisol fue la concentración de cloruro de potasio (KCl): 120 mM en solución UW y 5,33 mM en Optisol. De hecho, Optisol complementado con KCl a 120 mM perjudicó la morfología del tejido retiniano (Fig. 4a complementaria). De manera consistente, la concentración de KCl en BSS y el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM, medio basal utilizado para el cultivo de células de mamíferos) fue de 5, 3 mM y se consideró preferible la conservación a 17 ° C en BSS y DMEM (Fig. 4a y Fig. Suplementaria. 4b). Estos resultados plantean la posibilidad de que la concentración de KCl sea un factor clave para la solución de conservación. Basándonos en estos resultados, elegimos Optisol como solución de conservación sin congelación, ya que Optisol se usa ampliamente clínicamente para el trasplante de córnea humana51.

a Detección de las condiciones de conservación sin congelación. +++: se conservó el epitelio retiniano continuo multicapa. ++: se conservó el epitelio retiniano continuo multicapa pero aparecieron rosetas neurales. +: se observó epitelio retiniano continuo multicapa pero muy limitado. –, no se observó epitelio retiniano continuo multicapa tras la preservación. b Esquema de los experimentos de conservación. c Proporciones de precursores de fotorreceptores Crx+ en tejidos retinianos multicapa. Las proporciones se calcularon dividiendo el número de células Crx+ por el número de núcleos (DAPI). Los datos se presentan como media ± SE para n = 5 (4 °C), 4 (12 °C), 4 (15 °C), 5 (17 °C), 5 (20 °C), 5 (22 °C) ), 4 (37 °C) y 3 (cultivo de control). d Viabilidad celular en retinas no conservadas (Control) y retinas conservadas durante 4 días. Los datos se muestran como media ± SE (n = 5 por grupo). e Expresiones génicas de Chx10 y Crx en retinas no conservadas (Control) y retinas conservadas durante 4 días. Los datos se presentan como media ± SE (n = 3 por grupo). f Análisis IHC de retinas que no se conservaron (d70 + 0), conservadas en Optisol durante 2 días (d70 + 2) y 4 días (d70 + 4), y conservadas en Optisol durante 4 días seguido de cultivo de recuperación durante 3 días ( d70 + 4 + 3) y 7 días (d70 + 4 + 7). Tinción Ki67 (roja) en los paneles superiores. Tinción EdU (verde) en paneles inferiores. DAPI se muestra en azul. Barra de escala: 50 µm. g Número de células positivas para EdU por tejido retinal multicapa de 100 µm de ancho en cada grupo. Los datos se presentan como media ± SE (n = 6 por grupo). ***p < 0,001 para ANOVA unidireccional seguido de una prueba de Tukey. h Esquema de disección, prueba de PCR en anillo y envío de láminas de retina. ns, no significativo.

Para determinar la temperatura óptima de conservación, las retinas 3D se conservaron en Optisol a 4, 12, 15, 17, 20, 22 y 37 °C durante 3 días y luego se cultivaron en medio de maduración retinal a 37 °C durante 7 días como el cultivo de recuperación (Fig. 4b). Realizamos análisis IHC y encontramos que las proporciones de células Crx+ eran más altas a 12, 15, 17, 20 y 22 °C que a 4 y 37 °C y que las proporciones de células Crx+ a 17, 20 y 22 °C eran mucho más altos (Fig. 4c). Por lo tanto, el rango preferible de temperatura de conservación fue de 17 ± 5 °C y la temperatura óptima fue de 17 a 22 °C.

Examinamos la viabilidad celular y la expresión génica en retinas conservadas en Optisol a 17 °C durante 4 días. La viabilidad celular en las retinas preservadas superó el 95% y fue similar a la de las retinas de control en cultivo (Fig. 4d). Los niveles de ARNm de Chx10 y Crx en las retinas conservadas fueron comparables a los de las retinas de control en cultivo (Fig. 4e). Además, los niveles de ARNm de Chx10 y Crx en retinas conservadas en Optisol a 17 °C durante 7 días fueron comparables a los de las retinas de control en cultivo. Estos resultados demostraron que la conservación sin congelación en Optisol a 17 °C era la condición óptima para el tejido retiniano.

Analizamos el estado de los tejidos retinianos conservados a 17 °C. Retinas de control antes de la conservación (d70 + 0), retinas conservadas en Optisol a 17 °C durante 2 días (d70 + 2) y 4 días (d70 + 4), y retinas recuperadas por cultivo a 37 °C durante 3 días (d70 + 4 + 3) y 7 días (d70 + 4 + 7) se trataron con el análogo de timidina 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) durante 4 h para marcar las células en proliferación en la fase S del ciclo celular y se sometieron a análisis histológicos. análisis. La expresión de Ki67 se detectó en ambas retinas de control antes de la conservación y retinas conservadas a 17 ° C (Fig. 4f, d70 + 2 y d70 + 4). Por el contrario, no se detectaron células EdU+ en retinas conservadas a 17 °C (Fig. 4f, g, d70 + 2 y d70 + 4), lo que indica que los progenitores retinales conservados se detuvieron antes de entrar en la fase S. Es importante destacar que la absorción de EdU se reguló durante el cultivo de recuperación, lo que indica que la capacidad de proliferación era reversible (Fig. 4f, g y Fig. 4c, d complementaria). El número de células caspasa-3+ escindidas (células apoptóticas) fue ligeramente alto en las retinas preservadas, mientras que el número en las retinas recuperadas (d70 + 4 + 3 y d70 + 4 + 7) fue similar al de las retinas de control (Suplementario Figura 4c).

Combinando el método de conservación sin congelación a temperatura ambiente controlada (método de conservación RT en lo sucesivo) con la prueba de PCR en anillo, desarrollamos un método de control de calidad para la disección de retinas 3D (Proceso 5) de la siguiente manera: (1) disección de la tapa y anillo de cada 3D-retina, (2) conservación de las tapas a 17 °C por el método de conservación RT, (3) prueba de PCR en anillo para seleccionar los anillos aprobados y no aprobados, (4) exclusión de las tapas correspondientes a anillos fallidos para seleccionar las hojas de retina (productos finales), y (5) envío de las hojas de retina para trasplante (Fig. 4h).

Se llevó a cabo un estudio de tumorigenicidad in vivo de la lámina retiniana mediante trasplante subretiniano en ratas desnudas inmunodeficientes. Las láminas de retina se generaron a partir de células iPSC-Q y se almacenaron mediante el método de conservación RT durante 3 a 4 días. Las ratas desnudas inmunodeficientes se dividieron en grupos intactos (n = 8), cirugía simulada (n = 12) y trasplantados (n = 21), y las ratas en el último grupo se sometieron a un trasplante subretiniano de una lámina retiniana en el espacio subretiniano ( Figura complementaria 5a-f). Cada hoja de retina trasplantada (injerto) se ubicó correctamente en el espacio subretiniano, como lo confirmaron las imágenes del fondo de ojo y el análisis de tomografía de coherencia óptica (OCT) (Fig. 5b complementaria).

Las ratas trasplantadas no mostraron anomalías en el peso corporal, las tasas de supervivencia ni los signos clínicos en comparación con las ratas intactas o simuladas durante el período de observación de hasta 78 semanas después del trasplante (Fig. 5a, b).

Cursos temporales de peso corporal ( a ) y curvas de supervivencia de Kaplan-Meier ( b ) en ratas desnudas en el estudio de tumorigenicidad. Intacto: rata desnuda de control sin cirugía (n = 4). Falso: rata desnuda de control con inyección subretiniana de control de vehículo (n = 4). Trasplantado: rata desnuda con trasplante subretiniano de una única hoja de retina derivada de iPSC-Q (n = 4). Los datos se presentan como media ± SE. c, d Tinción con HE de secciones de ojos trasplantadas a las 13, 26, 52 y 78 semanas después del trasplante. Barra de escala: 100 µm. e–h Inmunotinción de secciones de ojos trasplantados para marcadores nucleares humanos, marcadores retinales y Ki67. Barra de escala: 20 µm. e Inmunotinción para HuNu (verde), Recoverin (rojo), Chx10 (blanco) y DAPI (azul). f Inmunotinción para humanos Ku80 (verde), Ki67 (rojo) y DAPI (azul). g Imagen de gran aumento de inmunotinción para el injerto (52 semanas) con anticuerpos para humanos Ku80 (verde), Ki67 (rojo) y DAPI (azul). La flecha indica las células Ki67+ y Ku80+. h Porcentajes de células Ki67+ y Ku80+ entre las células humanas Ku80+. Los datos se presentan como media. Capa nuclear interna INL.

El análisis histopatológico de los injertos a las 13, 26, 52 y 78 semanas después del trasplante no reveló características proliferativas o malignas como la atipia nuclear (Fig. 5c, d). Luego se realizaron análisis IHC de los injertos (Fig. 5e-h). Los porcentajes de células humanas en proliferación (Ki67+ y Ku80+) entre las células humanas (Ku80+) fueron <1 % en cada punto de tiempo, lo que indica una proliferación muy limitada de las células del injerto (Fig. 5f, g, h)52,53. Se encontró que las células del injerto se diferenciaban en fotorreceptores (Recoverin+ y HuNu+) y células bipolares (Chx10+ y HuNu+) (Fig. 5e). Específicamente, las láminas retinales derivadas de iPSC-Q se injertaron >1,5 años después del trasplante, incluso en condiciones de xenotrasplante.

En este estudio, no se observó tumorigenicidad ni otros efectos adversos relacionados con las láminas de retina derivadas de iPSC-Q.

Para examinar si las láminas retinianas preservadas podrían injertarse y diferenciarse en fotorreceptores maduros en condiciones severamente degeneradas, realizamos un estudio de trasplante utilizando ratas desnudas modelo de degeneración retiniana en etapa terminal que portaban un transgén de rodopsina humana mutado (SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav ratas desnudas , RD-ratas desnudas en lo sucesivo)54,55. Las láminas de retina derivadas de iPSC almacenadas por el método de conservación de RT durante 3 a 4 días se trasplantaron subretinalmente en ratas desnudas RD de 20 a 30 semanas de edad. A las 24–44 semanas después del trasplante, las células bipolares de rata/huésped PKCalpha+ y Recoverin+ aún existían, mientras que los fotorreceptores de rata/huésped estaban casi completamente degenerados en esta etapa (Fig. 6a y Fig. 6a complementaria, área de control). Los fotorreceptores humanos Recoverin+ y Ku80+ se injertaron en las retinas de rata gravemente degeneradas para formar estructuras de rosetas de fotorreceptores (Fig. 6a' y Fig. 6b, c, d complementaria), de acuerdo con estudios previos8,35,36,39.

a–j' Inmunotinción de ojos de rata trasplantados con láminas de retina derivadas de iPSC-S17. Las láminas retinales se trasplantaron en el espacio subretiniano de ratas desnudas RD. Las retinas de rata se fijaron 263 días después del trasplante (341 días después del inicio de la diferenciación). a, a' inmunotinción para Ku80 humano (verde), Recoverin (rojo) y PKCalpha (blanco). Área de control no trasplantada (a). Área injertada (a'). Puntas de flecha en (a): células bipolares de rata Ku80−, Recoverin+ y PKCalpha+ humanas. b–b" Inmunotinción para Ku80 humano (verde), S-arrestin (rojo) y Cone-arrestin (blanco). El área encuadrada en (b) corresponde a (b'). Gran aumento en (b') y mayor aumento en (b"). c–h' Inmunotinción para marcadores de fotorreceptores. NRL (verde), Recoverin (rojo) y RXRG (blanco) en (c, c'). S-opsina (verde) y L/M-opsina (roja) en (d). GNAT1 (verde) y PRPH2 (rojo) en (e, e'). GNAT2 (verde) y PNA (rojo) en (f). Ku80 humano (verde), sinaptofisina (rojo) y PKCalpha (blanco) en (g–g"). Puntas de flecha en (g', g"): neuritas positivas para sinaptofisina sin espacio nuclear. Ku80 humano (verde), Calbindin (rojo) y S-arrestin (blanco) en (h, h'). Puntas de flecha en (h'): neuritas positivas para calbindina. i, i' Imagen de proyección máxima de pilas Z inmunoteñidas para Ku80 humano (verde), Recoverin (rojo) y PKCalpha (blanco) en (i, i'). Tenga en cuenta que las células bipolares humanas Ku80- y PKCalpha+ se ubicaron cerca de los fotorreceptores humanos Ku80+ y Recoverin+ (puntas de flecha). j, j' Imagen de proyección máxima de pilas Z teñidas para CtBP2 (verde), LRIT3 (rojo) y PKCalpha (blanco). Gran aumento en (j'). Tenga en cuenta que el marcador de sinapsis fotorreceptora CtBP2 y LRIT3 se expresaron cerca de las neuritas de las células bipolares de varilla PKCalpha+. Tinción DAPI (azul) en (a, a', b–b", c, d, e, e', f, g, g', h, i, j, j'). Barras de escala: 100 µm en ( a, a', b), 10 µm en (b', b", c–j) y 1 µm en (j'). Capa nuclear interna INL, capa de células ganglionares GCL.

Además, examinamos la maduración de los fotorreceptores injertados mediante la expresión de varilla, cono, segmento externo (OS), capa plexiforme externa (OPL) y marcadores sinápticos. Las rosetas de fotorreceptores contenían tanto fotorreceptores de bastón S-arrestin+ como fotorreceptores de cono Cone-arrestin+ (Fig. 6b, b', b"). Las rosetas de fotorreceptores también contenían precursores de bastón NRL+, precursores de cono RXRG+ y algunos fotorreceptores de cono maduros positivos para S- opsina y L / M-opsina (Fig. 6c, c ', d). Los bastones y conos en las rosetas de fotorreceptores fueron positivos para marcadores de fototransducción (GNAT1 y GNAT2) y marcadores OS (PRPH2 y PNA), lo que indica que los bastones y conos maduraron para formar estructuras similares a OS (Fig. 6e, e', f). Las neuritas de sinaptofisina+ y las células horizontales de Calbindina+ residían alrededor de las rosetas de fotorreceptores humanos, lo que indica que se formó la estructura similar a OPL (Fig. 6g, g', g", h, h', puntas de flecha). Las imágenes de mayor aumento mostraron que los fotorreceptores humanos Recoverin+ y Ku80+ estaban en contacto directo con las células bipolares de huésped/rata PKCalpha+ y Ku80− (Fig. 6i, i', puntas de flecha). También observamos la expresión de los marcadores presinápticos fotorreceptores CtBP2 (Ribeye) y LRIT3 en las puntas de las dendritas bipolares PKCalpha + (Fig. 6j, j '). Estos resultados demostraron que las láminas de retina preservadas se injertaron en ratas inmunodeficientes modelo RD grave para diferenciarse en fotorreceptores maduros con estructuras similares a OS y OPL.

Para demostrar la capacidad de respuesta a la luz de las láminas de la retina, realizamos ensayos de electrofisiología ex vivo utilizando una matriz de electrodos múltiples (MEA). Se trasplantaron hojas de retina derivadas de iPSC-S17 en los días de diferenciación 81 a 95 después de la conservación de RT durante 3 días en el espacio subretiniano de 12 ratas desnudas RD de 20 a 30 semanas de edad. Los ojos no trasplantados se usaron como controles emparejados por edad. Las ratas se sometieron a un análisis MEA ex vivo entre 8 y 9 meses después del trasplante para evaluar los recuentos de picos derivados de las células ganglionares de la retina (RGC) y las respuestas a la luz de las RGC como se describió anteriormente36,56. Se aplicaron estímulos de luz a tres intensidades (débil, media, fuerte) y se realizaron registros electrofisiológicos en tres condiciones: antes de la adición del bloqueador del receptor metabotrópico de glutamato (mGluR6) L-AP4 (antes), después de la adición de L-AP4 (L- AP4), y después del lavado de L-AP4 (Después del lavado) (Fig. 7a, b). La longitud del área injertada fue de aproximadamente 1,0 a 2,0 mm (Fig. 7b, línea roja). El área injertada se montó en los electrodos. Los histogramas de tiempo de periestímulo de los recuentos de picos de RGC sugirieron que se detectaron picos de RGC inducidos por estímulos de luz en la retina trasplantada (Fig. 7c, superior). En una grabación representativa (Fig. 7c, cuadro y Fig. 7d), se observaron recuentos de picos de RGC aumentados después del inicio del estímulo de luz (Fig. 7d, Antes). La adición de L-AP4 atenuó los picos de RGC inducidos por el estímulo de luz (Fig. 7c, d, L-AP4). Después del lavado de L-AP4, los picos de RGC inducidos por el estímulo de luz reaparecieron con una mayor capacidad de respuesta (Fig. 7d, después del lavado). Por el contrario, se detectaron pocos picos de RGC inducidos por estímulos de luz en las retinas de control no trasplantadas (Fig. 7c, d, abajo). Estos resultados indicaron que las respuestas a la luz de RGC en las retinas de rata trasplantadas se derivaron de las láminas de retina humana injertadas y dependían de la transmisión sináptica de los fotorreceptores injertados a las células bipolares. Respuestas de luz de RGC similares fueron evidentes en 2 de 13 ojos trasplantados con láminas de retina derivadas de iPSC-Q después de la conservación de RT (Figuras complementarias 7a, b). Incluso las láminas de retina iPSC trasplantadas después de la conservación de RT durante 4 días mostraron respuestas a la luz RGC (y la Fig. 7c, d complementaria).

un esquema de ensayo de electrofisiología ex vivo usando MEA para evaluar las respuestas a la luz en iPSC-retinas trasplantadas. Se trasplantaron láminas retinales derivadas de iPSC-S17 en el espacio subretiniano en ratas desnudas RD. Las retinas de rata trasplantadas y no trasplantadas se montaron en los electrodos MEA para el registro electrofisiológico. Durante el registro, se realizaron estímulos de luz en diferentes intensidades (débil, media, fuerte) y las retinas de rata se incubaron en medio de Ames (antes), seguido de la adición de L-AP4 (L-AP4) y lavado de L -AP4 (Después del lavado). b–d Resultados representativos del análisis MEA. ( b ) Imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) de una retina de rata desnuda RD montada en el MEA. El área injertada se indicó mediante una línea de puntos roja. Barra de escala: 1 mm. c, d Histogramas de tiempo peri-estímulo para examinar los recuentos de picos de RGC durante estímulos de luz intensos (12,84 log fotones/cm2/s). El eje X y el eje Y representan el tiempo y el recuento promedio de picos de RGC, respectivamente. Se muestran los datos de registro de retinas de rata trasplantadas con hoja de retina derivada de iPSC-S17 (trasplantadas; superior) y retinas de rata no trasplantadas (no trasplantadas; inferior) en las tres condiciones (antes, L-AP4, después del lavado). Los datos de registro de electrodos múltiples se muestran en (c) y los datos representativos (recuadro rojo en c) se muestran en (d). Recuadro amarillo en (c, d): estímulos luminosos. Flechas rojas en (d): iniciar el tiempo de los estímulos de luz. e RGC probabilidades de respuesta a la luz. Las retinas de rata no trasplantadas de control (control; n = 12) y las retinas de rata trasplantadas con hoja de retina derivadas de iPSC-S17 (trasplantadas; n = 12) se sometieron a análisis MEA para evaluar las respuestas de RGC a la estimulación con luz. Los puntos y las barras muestran el resumen por muestra (retina de rata registrada) de los datos recopilados. Punto: probabilidad de respuesta a la luz RGC estimada mediante modelado estadístico (inferencia estadística bayesiana con muestreo de Markov Chain Monte Carlo). Barra: intervalo de confianza del 89%.

Para confirmar aún más el potencial funcional de las láminas de retina, comparamos la probabilidad de respuestas de luz RGC en retinas no trasplantadas (Control) y trasplantadas. El número de RGC con picos de respuesta a la luz por el número de RGC registrados (probabilidad de respuesta a la luz de RGC) se estimó utilizando la inferencia estadística bayesiana como se describe56. En retinas de rata no trasplantadas, rara vez se detectaron respuestas de luz RGC robustas para los estímulos de luz débil, medio y fuerte (Fig. 7e, Control y Antes; 0 respuestas de luz en 12 retinas de rata, 0%). En retinas de rata trasplantadas con láminas de retina derivadas de iPSC-S17, se observaron respuestas de luz RGC robustas con probabilidad de respuesta promedio> 0.25 en dos retinas de rata para estímulos de luz de medianos a fuertes (Fig. 7e, Trasplantado y Antes; 2 respuestas de luz en 12 retinas de rata, 17%). Las respuestas a la luz RGC detectadas fueron predominantemente de tipo ON porque mostraron atenuación en presencia de L-AP4 (Fig. 7e, Trasplantado y L-AP4) y reaparecieron después de que L-AP4 se eliminó (Fig. 7e, Trasplantado y después del lavado) . Tenga en cuenta que las respuestas a la luz de RGC mejoraron después del lavado con L-AP4 (Fig. 7e, Trasplantado y Después del lavado versus Trasplantado y Antes), de acuerdo con el estudio anterior56. Después del lavado con L-AP4, se observaron respuestas a la luz de RGC en tres retinas trasplantadas para estímulos de luz débil y seis retinas trasplantadas para estímulos de luz de medianos a fuertes (Fig. 7e, Trasplantado y después del lavado; 6 respuestas a la luz en 12 retinas de rata, 50 %). Estos resultados demostraron que las láminas de retina iPSC trasplantadas después de la conservación con RT exhibieron funciones de respuesta a la luz de RGC (6 respuestas a la luz en 12 retinas de rata trasplantadas [50 %] versus 0 respuestas a la luz en 12 retinas de rata de control [0 %]) (Fig. 7e) .

Curiosamente, se observaron respuestas a la luz de RGC en láminas de retina trasplantadas en los días de diferenciación 81–83 (n = 7) y 90–95 (n = 5), lo que indica que las láminas de retina aproximadamente en el día 80 y aproximadamente en el día 90 tenían el potencial de mejorar. respuestas a la luz en ratas modelo de degeneración retiniana y que el rango permitido de días de diferenciación para la eficacia puede ser amplio (Fig. 8a complementaria). Además, se observaron respuestas de luz de RGC en ojos trasplantados en ratas desnudas RD macho y hembra, lo que indica que el trasplante de lámina de retina mejoró las respuestas de luz de RGC en animales machos y hembras (Fig. 8b complementaria).

En conjunto, los estudios de eficacia demostraron que las láminas de retina derivadas de iPSC conservadas a 17 °C durante 3 o 4 días tenían el potencial de injertarse y madurar en las retinas de rata desnuda RD severamente degeneradas para exhibir las funciones de respuesta a la luz de RGC medidas por ex ensayos de electrofisiología vivo. Estos estudios de seguridad y eficacia en las láminas de retina demostraron que los métodos de conservación QC y RT eran razonables para la generación de láminas de retina trasplantables (Fig. 9 complementaria).

La tecnología de cultivo de células madre autoorganizadas permite la generación de organoides y tejidos 3D en una placa1. El trasplante de tejido/organoide autoorganizado es un enfoque atractivo para la medicina regenerativa en la degeneración de la retina. Estudios previos han demostrado que las láminas de hPSC-retina se injertaron durante 0,5 a 2 años en roedores modelo de degeneración de fotorreceptores en etapa terminal y primates no humanos8,35,36,37,39,57. Las tecnologías restantes clave para el trasplante de tejidos/organoides fueron una estrategia de control de calidad y un método de conservación. En este estudio, desarrollamos una estrategia de control de calidad para láminas de retina derivadas de hPSC. El tejido retiniano en cultivo autoforma una estructura morfológica única que es fácil de distinguir bajo un microscopio y, por lo tanto, las láminas retinianas se pueden diseccionar. Para excluir posibles errores en la selección de tejido retiniano y evitar los tejidos fuera del objetivo, caracterizamos los principales tejidos fuera del objetivo y desarrollamos la prueba de PCR en anillo. El tejido retinal con su gran estructura neuroepitelial continua se puede diseccionar en dos láminas de tejido: la lámina central interna (tapa) y la lámina periférica externa (anillo) con patrones de expresión génica similares. Por lo tanto, el análisis de qPCR del anillo se puede utilizar para estimar la expresión génica en la tapa correspondiente. Como la prueba de PCR en anillo requiere de 1 a 2 días para completarse, desarrollamos el método de conservación de RT para almacenar láminas de retina durante al menos 3 a 4 días. Para demostrar la justificación de la estrategia de control de calidad y el método de conservación en tiempo real, realizamos estudios de eficacia preclínica y tumorigenicidad in vivo. En el estudio de tumorigenicidad, no se observaron tumores ni otros efectos adversos relacionados con las láminas de retina derivadas de iPSC. El estudio de eficacia preclínica demostró que las láminas de retina preservadas tenían el potencial de injertarse y madurar en condiciones de degeneración severa y exhibieron funciones de respuesta a la luz medidas por ensayos de electrofisiología ex vivo. Estos estudios preclínicos respaldan el concepto de trasplante de láminas de retina derivadas de iPSC para la degeneración de la retina.

Con base en estudios actuales y previos5,6,7,8,27,33,34,35,36,37,38,39, el hospital oftalmológico de la ciudad de Kobe solicitó investigación clínica para un número limitado de pacientes que utilizan láminas retinales derivadas de iPSC para retinitis pigmentosa. En junio de 2020, el Consejo de Ciencias de la Salud del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón aprobó el plan de investigación clínica y se inició la investigación clínica (ID de ensayo: jRCTa050200027). Sumitomo Pharma desarrolló un proceso de fabricación de grado clínico y generó láminas de retina derivadas de iPSC alogénicas de grado clínico. Las hojas iPSC-retinianas se trasplantaron en dos pacientes en 2020-2021.

El presente estudio se basa en una tecnología de cultivo autoorganizado altamente eficiente y robusta. La combinación de métodos de SFEBq, BMP, preacondicionamiento e inducción-reversión permite un sólido cultivo de diferenciación 3D autoorganizado para la generación de tejido retiniano con un gran neuroepitelio continuo7,8. Esta gran estructura continua de neuroepitelio tenía un tamaño de 1 a 3 mm en la dirección tangencial y era fácil de distinguir bajo el microscopio, lo que permitía disecar la tapa y el anillo. El tejido retiniano autoorganizado con neuroepitelio continuo se diferenció de forma reproducible para formar una estructura multicapa con precursor de fotorreceptor Crx+ y capas de células progenitoras retinianas Chx10+ de varias líneas de hPSC utilizando nuestros protocolos o diferentes protocolos de cultivo6,12,13,14,18,19,22. Esta característica de autoorganización 3D posiblemente basada en el programa de desarrollo embrionario intrínseco es la tecnología central para la generación robusta de láminas retinales con calidad controlada.

Una de las características del método QC en el presente estudio fue la disección y análisis del anillo para verificar la calidad de la tapa. Este enfoque de tapa y anillo podría utilizarse para otros organoides con un epitelio continuo, como los organoides corticales, hipocampales, pituitarios e intestinales40,58,59,60. Aunque la disección manual de tejidos diminutos es un procedimiento experimental predominante en la investigación que utiliza embriones tempranos de Xenopus o cerebros en desarrollo de ratón para el cultivo de células precursoras neurales primarias33,39, la automatización y la mecanización del proceso de disección serán importantes para la fabricación futura de láminas retinales derivadas de iPSC.

Para examinar la calidad del anillo, una prueba de control de calidad candidata fue el análisis de qPCR y las otras fueron el análisis de IHC, la citometría de flujo, el análisis de chips genéticos (microarray), el ARN-seq y el análisis de células individuales. Elegimos qPCR en este estudio porque permite ensayos de alto rendimiento para analizar muchas muestras en un período relativamente corto, tiene una alta sensibilidad y es técnicamente fácil48. Las otras pruebas de control de calidad también tenían puntos fuertes. Un estudio reciente que utilizó el enfoque RNA-seq reveló que las células fuera del objetivo Six6-negativas en el cultivo de diferenciación retiniana utilizando el método Matrigel contienen múltiples células neuronales, incluidas las células positivas para Emx2 y las células positivas para HoxB261. Además, los análisis de células individuales, como RNA-seq de células individuales, son tecnologías poderosas, y varios grupos han informado estudios pioneros13,62,63,64,65. Mientras tanto, las tecnologías de imagen y el procesamiento computacional de imágenes, como las tecnologías de aprendizaje profundo, son enfoques prometedores para el desarrollo de pruebas de control de calidad no destructivas. En estudios futuros, nos gustaría continuar con el análisis de células individuales y la tecnología de imágenes para investigar más a fondo la calidad de las retinas 3D autoorganizadas.

Aunque la crioconservación es un enfoque atractivo para el suministro mundial, las láminas de retina crioconservadas exhibieron un injerto deteriorado. Por lo tanto, necesitábamos desarrollar un método de conservación sin congelación y descubrimos que la temperatura óptima para la conservación de láminas de retina era casi la temperatura ambiente (17 ± 5 °C). Se informó la conservación a temperatura ambiente para el tejido hepático49, y nuestro estudio demostró que la temperatura cercana a la ambiente era adecuada para tejidos neurales como el tejido retiniano. Las bajas temperaturas alrededor de 4 °C causaron daño a los tejidos, posiblemente por un metabolismo intracelular anormal a 4 °C49. El cultivo a 37 °C bajo 5 % de CO2 fue adecuado para el crecimiento celular, pero la morfología de las láminas retinales cambió durante el cultivo autoorganizado. La conservación en RT a 17 ± 5 °C podría mantener la morfología de las láminas retinales. Durante la conservación en RT, el tejido retiniano se detuvo para entrar en la fase S, lo que aumenta la posibilidad de que la proliferación se detenga en esta condición de conservación. La conservación de RT se informó recientemente para RPE y tejido retiniano66,67. Desarrollamos un método de conservación en RT y realizamos estudios de trasplante, incluido un estudio de tumorigenicidad de 1,5 años, para láminas de retina en condiciones de conservación en RT.

Hacia las aplicaciones clínicas, evaluamos la tumorigenicidad y la eficacia in vivo de las láminas retinales de iPSC generadas mediante la prueba de PCR en anillo y el método de conservación en RT. En el estudio de tumorigenicidad, no se observaron tumores ni otros efectos adversos relacionados con las láminas retinianas. Las láminas iPSC-retinianas conservadas en RT se injertaron y maduraron en ratas desnudas RD para formar rosetas de fotorreceptores. Se observaron estructuras de rosetas de fotorreceptores similares en trasplantes de tejido de retina fetal derivados de donantes humanos en ratas68. Aunque la mitad de los fotorreceptores iPSC humanos en rosetas en el lado RPE del huésped estaban lejos de las células bipolares de rata/huésped, la otra mitad de los fotorreceptores iPSC humanos en rosetas en el lado RGC del huésped podrían contactar con células bipolares de rata/huésped. Los fotorreceptores iPSC injertados in vivo maduraron para formar la estructura similar a OS en la superficie apical interna de las rosetas y la estructura similar a OPL con expresión de marcador sináptico fotorreceptor en el lado basal externo adyacente a las células bipolares y células horizontales. La microscopía electrónica será clave para demostrar las conexiones sinápticas entre los fotorreceptores injertados y las células bipolares del huésped. Es importante destacar que el 50% de los trasplantes de iPSC-retina exhibieron respuestas a la luz monitoreadas por grabaciones MEA ex vivo. Esta tasa fue comparable a los resultados anteriores para el trasplante de iPSC-retinas frescas sin conservación RT (4 respuestas a la luz en 7 ojos de rata trasplantados, 57 %)36. Estas observaciones demostraron que las láminas iPSC-retinianas conservadas en RT trasplantadas en la condición de degeneración retiniana en etapa final se injertaron y diferenciaron en fotorreceptores maduros y exhibieron respuestas de luz RGC. En un estudio futuro, será interesante investigar la capacidad de respuesta a la luz de las láminas de retina conservadas con RT en el cerebro y los niveles de comportamiento37.

Hacia futuras aplicaciones clínicas en un gran número de pacientes, más estudios preclínicos serán clave. Entre ellos, los estudios en animales grandes para desarrollar procedimientos quirúrgicos, dispositivos de trasplante y protocolos de inmunosupresión son importantes para permitir el uso generalizado de láminas de retina. Basado en la tecnología de cultivo de células madre autoorganizadas, la realización de la terapia de tejido/organoide en medicina está en curso.

Se establecieron dos líneas iPSC humanas, iPSC-LPF11 e iPSC-S17, a partir de células de sangre periférica utilizando vectores del virus Sendai de Sumitomo Pharma8. La línea iPSC-QHJI01s04 (iPSC-Q) fue establecida por iPSC Stock Project organizado por el Centro de la Universidad de Kioto para la Investigación y Aplicación de Células iPS (CiRA) y proporcionada por la Universidad de Kioto69,70. La línea iPSC-1231A3 establecida en la Universidad de Kioto y derivada de ePBMC(R) adquirida de Cellular Technology Limited (http://www.immunospot.com/) fue proporcionada por la Universidad de Kioto41. Los protocolos experimentales que utilizan iPSC humanas de grado clínico fueron aprobados por el Comité de ética de investigación de Sumitomo Pharma Co., Ltd., Japón.

Los métodos de cultivo de hPSC sin alimentador, SFEBq, preacondicionamiento, d0-SAG, BMP y cultivo de inversión de inducción se realizaron como se describe6,7,8,41 con ligeras modificaciones. En el Proceso 1 (cultivo de mantenimiento), las iPSC humanas se mantuvieron en matriz LM511-E8 (Nippi) en medio StemFit (Ajinomoto) de acuerdo con un protocolo publicado41 con ligeras modificaciones8. El medio se cambió cada 1 o 2 días hasta que las células alcanzaron una confluencia del 70 al 80 %. Las iPSC se pasaron utilizando TrypLE Select Enzyme (Thermo Fisher Scientific) y se disociaron en células individuales mediante pipeteo suave. Las iPSC disociadas se sembraron a una densidad de 700–1700 células/cm2 y se cultivaron en placas de cultivo de seis pocillos recubiertas con matriz LM511-E8 (Iwaki) que contenían medio StemFit con 10 µM Y-27632 (Wako)8. Antes de la diferenciación, las iPSC se trataron con SB431542 (SB; Wako) y/o agonista suavizado (SAG; Enzo Biochem) como paso de preacondicionamiento.

En el Proceso 2 (diferenciación retinal), las hPSC se trataron con TrypLE Select Enzyme a 37 °C durante 4–7 min y se disociaron en células individuales mediante pipeteo suave. Las iPSC disociadas se reagregaron rápidamente utilizando placas de 96 pocillos de baja adherencia celular con pocillos de fondo en V (placas Sumilon PrimeSurface; baquelita Sumitomo) en medio de diferenciación (gfCDM+KSR) con Y-27632 y SAG (método d0-SAG). El medio de diferenciación fue gfCDM complementado con 10 % de KSR, mientras que gfCDM solo comprendía 45 % de medio de Dulbecco modificado por Iscove (Gibco), 45 % de Hams F12 (Gibco), Glutamax, 1 % de concentrado de lípidos definidos químicamente (Gibco) y 450 µM de monotioglicerol ( Sigma-Aldrich). El día de inicio del cultivo de SFEBq se definió como el día 0. El día 3, se añadió BMP4 humana recombinante (R&D Systems) a 1,5 nM (55 ng/ml)7. A partir de entonces, el medio de cultivo se cambió cada 3 o 4 días para generar tejido retiniano inmaduro.

En el Proceso 3 (cultivo de inducción-reversión), el tejido retiniano inmaduro generado a partir de iPSC se sometió a un cultivo de inducción-reversión de dos pasos de la siguiente manera. Para el cultivo de inducción, los agregados celulares en los días 14 a 18 se transfirieron de placas de 96 pocillos a placas de Petri sin adhesivo celular de 90 mm (baquelita Sumitomo; aproximadamente 32 a 48 agregados/placa de 90 mm) y se cultivaron durante 3 días en medio DMEM/F12-Glutamax (Gibco) que contenía suplemento de N2 al 1 % (Gibco), CHIR99021 3 µM (inhibidor de GSK3; Wako) y SU5402 5 µM (inhibidor de FGFR; Wako). Para el cultivo de reversión (Proceso 3) y el cultivo de maduración (Proceso 4), los agregados celulares se cultivaron en medio de maduración de retina como se describe (Nukaya et al. WO2019017492A1, WO2019054514A1). El medio se cambió cada tercer o cuarto día para obtener retinas 3D. Los agregados de células flotantes se analizaron utilizando un microscopio invertido (Keyence BZ-X810, Nikon Eclipse-Ti u Olympus IX83).

Cada agregado de células que contenía tejido neuroepitelial estratificado continuo se sometió a disección de la tapa y el anillo (Proceso 5). La parte central del tejido neuroepitelial se cortó del agregado celular bajo un microscopio como se describe39. La hoja de tejido neuroepitelial interior-central diseccionado se recogió como la tapa. Al mismo tiempo, la parte periférica exterior circundante del tejido neuroepitelial se cortó del agregado celular y se recogió como anillo. Las tapas y los anillos obtenidos se sometieron al método de conservación en RT y a la prueba de qPCR en anillo, respectivamente. Los gorros cuyos anillos pasaron la prueba de ring-PCR se usaron como láminas de retina para el trasplante.

Los anillos y otras muestras de tejido se lisaron con Buffer RLT (Qiagen) que contenía 2-mercaptoetanol al 1%, y el ARN total se extrajo y purificó usando un RNeasy Micro Kit (Qiagen). El ARN total se transcribió inversamente y se sometió a qPCR utilizando un sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems) o Biomark HD (Fluidigm) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Sobre la base de los valores de Ct para cada gen, se calcularon las puntuaciones Z para las tapas o anillos individuales. Los datos se visualizaron como mapas de calor utilizando la función heatmap.2 del paquete R/Bioconductor gplots. PCA se realizó utilizando la función prcomp en el paquete base de R. Los resultados de PCA se visualizaron utilizando el paquete R ggplot2. Los siguientes cebadores de qPCR (sondas TaqMan) se compraron de Applied Biosystems, Inc. y se usaron para el análisis de qPCR: GAPDH (Hs02758991_g1), ACTB (Hs01060665_g1), Sox2 (Hs01053049_s1), Pax6 (Hs00240871_m1), Rx (Hs00429459_m1), Chx10 (Hs01584047_m1 ), Recoverin (Hs00610056_m1), Blimp1 (Hs00153357_m1), NRL (Hs00172997_m1), Crx (Hs00230899_m1), MITF (Hs01117294_m1), Aqp1 (Hs01028916_m1), Emx2 (Hs00244574 _m1), HoxB2 (Hs01911167_s1) y Lin28a (Hs00702808_s1).

Los tejidos disecados en los agregados celulares se lisaron con Buffer RLT (Qiagen) que contenía 2-mercaptoetanol al 1%, y el ARN total se extrajo y purificó usando un RNeasy Micro Kit (Qiagen). El análisis de micromatrices utilizando una matriz GeneChip fue realizado por Kurabo Industries (Osaka, Japón). Brevemente, el ARN total se transcribió inversamente a ADNc con el cebador T7 oligo d(T) (Affymetrix). A continuación, se sintetizó el cRNA marcado con biotina y se amplificó mediante la transcripción in vitro del molde de cDNA de la segunda hebra utilizando T7 RNA polimerasa (Affymetrix). El ARNc marcado se purificó y fragmentó, se cargó en una matriz GeneChip® Human Genome U133 Plus2.0 (Affymetrix) y se hibridó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos de intensidad sin procesar de la matriz GeneChip se analizaron utilizando el software operativo GeneChip (Affymetrix). Los datos se transformaron logarítmicamente y se calculó logFC para cada gen. Los datos de logFC se visualizaron como mapas de calor usando la función heatmap.2 del paquete R/Bioconductor gplots.

Se diseccionaron tapas y anillos de retinas 3D. La tapa cuyo anillo pasó la prueba de PCR en anillo se sometió a análisis scPCR. La tapa se disoció en células individuales mediante el uso de papaína (Wako), y luego se cargó en el preamplificador C1 IFC (10–17 μm, Fluidigm) para el aislamiento de células individuales. La preamplificación de genes se realizó en el instrumento C1 (Fluidigm) según las instrucciones del fabricante. Los ADNc preamplificados de cada célula se amplificaron aún más utilizando el instrumento Biomark HD (Fluidigm) con los ensayos TaqMan.

Los agregados celulares y las láminas de tejido (tapas) se transfirieron a tubos de 1,5 ml o 15 ml. Después de lavar el sobrenadante del cultivo, se añadió solución de conservación y los tubos se colocaron en incubadoras a 4, 12, 15, 17, 20, 22 y 37 °C. Para la validación de la temperatura, las temperaturas de las incubadoras fueron monitoreadas por registradores de temperatura en algunos experimentos. Como soluciones de conservación candidatas, se utilizaron Optisol-GS (Bausch & Lomb), solución salina equilibrada (BSS) (Gibco), Belzer UW Cold Storage Solution (Bridge to Life) y medios de cultivo celular. Para la conservación a temperatura ambiente de las tapas, cada tubo de 1,5 ml que contenía una tapa en Optisol se colocó en una incubadora fría (Mitsubishi Electric Engineering) a 17 °C. Las tapas que pasaron las pruebas de control de calidad, incluida la prueba de PCR en anillo, se recogieron y se usaron para el trasplante.

Las láminas de tejido que se diseccionaron de las retinas 3D se disociaron en células individuales usando papaína (Wako). Después de la centrifugación y eliminación de los sobrenadantes, las células disociadas se suspendieron en medio fresco. Las células totales y las células muertas se tiñeron con naranja de acridina y DAPI, y el número y el porcentaje de células viables se determinaron utilizando NucleoCounter® NC-200 (ChemoMetec).

Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de cuidado de animales del Centro RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas (BDR) y se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Se obtuvieron ratas desnudas SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav (ratas desnudas RD) del Rat Resource and Research Center54,55. El trasplante en el espacio subretiniano de ratas se realizó como se describe36. Se usaron ratas desnudas RD macho y hembra trasplantadas con láminas iPSC-retinianas para grabaciones de MEA a los 13,5 a 15 meses de edad (es decir, 8 a 10,5 meses después del trasplante). Las grabaciones MEA se realizaron utilizando el sistema USB-MEA60-Up (sistemas multicanal) como se describe36,56. Brevemente, las ratas desnudas RD se adaptaron a la oscuridad durante 1 a 3 días antes de su uso. Las ratas se anestesiaron y sacrificaron por inhalación en exceso de isoflurano o sevoflurano. Luego, sus copas oculares se recolectaron bajo una luz roja tenue con una longitud de onda máxima de 700 nm y se colocaron en medio de Ames oxigenado (Sigma-Aldrich) en la oscuridad. La retina se aisló cuidadosamente de la copa ocular y se eliminó el vítreo residual. La retina se montó con el lado RGC hacia abajo. El área injertada fue reconocida por su apariencia punteada y centrada en el electrodo. Se generaron estímulos de luz de campo completo con 10 ms y 1 segundo de duración a diferentes intensidades (débil: 10,56 log fotones/cm2/s; medio: 12,16 log fotones/cm2/s; fuerte: 12,84 log fotones/cm2/s) usando un LED blanco (NSPW500C; Nichia Corp.). Cada conjunto de estimulación, compuesto por 3 repeticiones para cada combinación de intensidad y duración de la estimulación, se repitió antes de agregar L-AP4 (antes), en presencia de 10 μM de L-AP4 (L-AP4, bloqueador de mGluR6, Wako), y después del lavado de L-AP4 (Después del lavado). Se aplicaron estímulos superfuertes (15,48 log fotones/cm2/s) al final de las grabaciones MEA para confirmar la viabilidad celular en las retinas. Los datos MEA se recopilaron a una frecuencia de muestreo de 20 kHz sin filtrado. Los picos registrados se ordenaron fuera de línea para contar los picos RGC utilizando la formación automática de plantillas y el algoritmo de coincidencia de picos en Spike 2 (versión 7.2; CED) con modificaciones menores56. Las respuestas de luz de RGC se definieron como tener un aumento de 2 veces en la frecuencia de picos contra el inicio y/o el final de la estimulación. El promedio de recuentos de picos de RGC y la probabilidad de respuesta de luz de RGC promedio (número de RGC con picos de respuesta a la luz por número de RGC registrados) se calcularon a partir de todos los RGC detectados en cada muestra como se describe36,56.

El estudio de tumorigenicidad in vivo con animales fue aprobado por el IRB de la Fundación para la Investigación e Innovación Biomédica (FBRI), el Comité de Experimentos con Animales de FBRI y el comité de cuidado de animales de RIKEN BDR. El trasplante subretiniano se realizó en RIKEN BDR. En este estudio se utilizaron ratas desnudas hembra para reducir las peleas entre ratas criadas en una misma jaula71. Se usaron ratas desnudas hembra de seis semanas de edad (ratas F344/NJcl-rnu/rnu; CLEA Japón) para el trasplante y se sometieron a observaciones del estado general y medidas de peso durante el período de observación. El estrés quirúrgico del trasplante subretiniano en ratas se evaluó en ojos operados de forma simulada (Fig. 5e, f complementaria). Las imágenes de fondo de ojo y el análisis OCT se realizaron utilizando RS-3000 Advance (Nidek) y Micron IV y OCT (Phoenix research labs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la necropsia, los globos oculares se fijaron a 4 °C en SUPERFIX (KY-500; Kurabo Japan), se incluyeron en parafina y se cortaron con un micrótomo a 3 µm de espesor. Una de cada cinco secciones se usó para tinción HE y análisis histopatológico, y las otras secciones se usaron para inmunohistoquímica.

IHC se realizó como se describe8. Los agregados de células y las retinas trasplantadas recolectadas de ratas desnudas RD se fijaron con paraformaldehído al 4% (Wako) y se seccionaron con un criostato (Leica) para preparar secciones congeladas. Las secciones congeladas y las secciones en parafina se trataron con o sin recuperación de antígeno basada en calor en solución Target Retrieval (Dako) a 105 °C durante 15 min. Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: anti-Chx10 (oveja; 1:500; Exalpha), anti-Pax6 (ratón; 1:1000; BD Biosciences), anti-Rx (conejillo de indias; 1:2000; Takara), anti -Crx (conejo; 1:200; Takara), anti-Recoverin (conejo; 1:500; Proteintech), anti-RXRG (ratón; 1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-NRL (cabra; 1:500; R&D Systems), anti-Lhx2 (conejo; 1:500; Millipore), anti-Rodopsina (ratón; 1:1000; Sigma Aldrich), anti-S-opsina (cabra; 1:1000; Santa Cruz Biotechnology), anti- S-opsina (conejo; 1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-L/M-opsina (conejo; 1:500; Millipore), anti-Cone-arrestin (Arrestin-3; cabra; 1:500; Novus) , anti-S-arrestina (ratón; 1:500; Novus), anti-CtBP2 (ratón; 1:500; BD Biosciences), anti-PKCalpha (cabra; 1:500; R&D Systems), anti-Ki67 (ratón; 1:500; BD Biosciences), anti-Aqp1 (Aquaporin1; conejo; 1:500; Millipore), anti-Emx2 (oveja; 1:100; R&D Systems), anti-caspasa-3 escindida (conejo; 1:200; tecnología de señalización celular), anti-HuNu (ratón; 1:500; Millipore), anti-humano Ku80 (conejo; 1:500; Cell Signaling Technology), anti-humano Ku80 (cabra; 1:500; R&D Systems), anti-Gnat1 (conejo; 1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-Gnat2 (conejo; 1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-PRPH2 (ratón; 1:500; Millipore), aglutinina de maní (PNA) (1:500; Thermo Fisher Scientific), anti-Sinaptofisina (cabra; 1:500; R&D Systems) y anti-LRIT3 (conejo; 1 :500; Novus). La contratinción nuclear se realizó con DAPI (Nacalai). Las secciones teñidas se analizaron con un microscopio de fluorescencia (Keyence BZ-X810) o un microscopio confocal de barrido láser (Olympus Fluoview FV1000D, Leica TCS SP-8 o Carl Zeiss LSM880). Los análisis de imágenes se realizaron con el software de imágenes IMARIS (Oxford Instruments), ImageJ (Institutos Nacionales de Salud) y Zen Blue (Carl Zeiss).

Para el etiquetado de EdU, controle las retinas antes de la conservación (d70 + 0), las retinas conservadas en Optisol a 17 °C durante 2 días (d70 + 2) y 4 días (d70 + 4), y las retinas recuperadas en cultivo a 37 °C durante 3 días. días (d70 + 4 + 3) y 7 días (d70 + 4 + 7) se trataron con el análogo de timidina EdU durante 4 h. Las retinas tratadas con EdU se fijaron y seccionaron con un criostato (Leica). Las secciones de las retinas se tiñeron con azida marcada con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio láser confocal y el número de células positivas para EdU y núcleos positivos para DAPI se contaron usando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud).

Los análisis estadísticos se realizaron con R versión 3.6.0 (The R Foundation for Statistical Computing). Se llevó a cabo una prueba t de Student de dos colas para comparaciones de dos grupos, y se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba de Tukey para comparaciones de grupos múltiples. Las diferencias entre grupos en el peso corporal y la tasa de supervivencia se evaluaron mediante ANOVA unidireccional y la prueba de rango logarítmico, respectivamente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todas las solicitudes razonables serán revisadas de inmediato por los autores principales para determinar si la solicitud está sujeta a alguna obligación de propiedad intelectual o de confidencialidad. Este estudio no generó nuevas líneas celulares. Los datos de origen para los gráficos se proporcionan como datos complementarios. Los datos del transcriptoma de micromatrices están disponibles con el número de acceso GSE197446.

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Agradecemos a CiRA (Kyoto, Japón) y CiRA Foundation (Kyoto, Japón) por brindarnos iPSC amablemente. Agradecemos al Dr. Mototsugu Eiraku por sus consejos sobre el cultivo de la maduración de la retina y a Yasushi Hiramine, Miki Iwata, Kazunari Tanaka, Masahiro Yahata, Koichiro Manabe, Kiyoko Bando, Jiro Akimaru, Keigo Kawabe, Kenji Yoshida, Satoshi Ando, ​​Atsushi Tsuchida, Tomokazu Nagano, y miembros de RACMO por fructíferos debates. Agradecemos a Ayumi Kiso por los estudios in vivo, Kohei Kanata por la tinción IHC y Yukiko Ishigami por la disección. A. Ku. desea expresar su profunda gratitud a su difunto mentor, el Dr. Yoshiki Sasai, un científico talentoso que fue pionero en la biología de células madre autoorganizadas. Este trabajo fue apoyado por la Red del Centro de Investigación para la Realización de la Medicina Regenerativa de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) (MT, SK).

Estos autores contribuyeron por igual: Kenji Watari, Suguru Yamasaki.

Centro de Kobe de medicina regenerativa y celular, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japón

Kenji Watari, Suguru Yamasaki, Tatsuya Kamei, Yasuyuki Kita, Masayo Fujiwara, Yoriko Hori, Anna Tanabe, Rina Hirai, Orie Terai, Osamu Ohno, Hidetaka Ohara, Tetsuya Hayama, Atsushi Ikeda, Daiki Nukaya, Keizo Matsushita, Akiyoshi Kishino, Toru Kimura y Atsushi Kuwahara

Laboratorio de Regeneración Retinal, Centro RIKEN para la Investigación de la Dinámica de Biosistemas, Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japón

Suguru Yamasaki, Hung-Ya Tu, Chikako Morinaga, Take Matsuyama, Junki Sho, Keizo Matsushita, Masayo Takahashi y Michiko Mandai

Centro de Investigación y Desarrollo para Terapia Celular, Fundación para la Investigación e Innovación Biomédica en Kobe, Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japón

Masayuki Shikamura, Miyuki Nakamura y Shin Kawamata

Unidad de Investigación Preclínica, División de Investigación, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Konohana-ku, Osaka, 554-0022, Japón

Hideki Adachi y Tomoaki Tochitani

División de Investigación y Desarrollo de Tecnología, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japón

Aya Nakamura, Kazuki Ueyama y Keiichi Ono

Programa RIKEN para Plataformas de Tecnología Médica y Descubrimiento de Fármacos, RIKEN Cluster for Science, Technology and Innovation Hub., Saitama, 351-0198, Japón

Chikako Morinaga y Michiko Mandai

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KW diseñó el estudio para el análisis de tejidos fuera del objetivo, la prueba de PCR en anillo y el método de conservación de RT, realizó experimentos, analizó datos y escribió el manuscrito. SY diseñó el estudio para la cultura autoorganizada y el análisis IHC in vivo, realizó experimentos, analizó datos y escribió el manuscrito. HYT diseñó y realizó el ensayo de electrofisiología, analizó los datos y escribió el manuscrito. MS, T.Ka., HA, TT, YK diseñaron y realizaron estudios de tumorigenicidad, analizaron datos y escribieron el manuscrito. AN, KU, KO, CM, TM, JS, MN, OT, OO, MF, YH, AT, RH, HO, TH, DN, KM realizaron experimentos y analizaron datos. AI, MT, A.Ki., T.Ki. manejó el proyecto y analizó los datos. SK supervisó y diseñó el estudio de tumorigenicidad in vivo, analizó los datos y escribió el manuscrito. MM concibió, supervisó y diseñó el estudio de eficacia in vivo, realizó experimentos, analizó datos y escribió el manuscrito. A. Ku. concibió, supervisó y diseñó el cultivo autoorganizado, el análisis de tejido fuera del objetivo, la prueba de PCR en anillo y el método de conservación de RT, realizó experimentos, analizó datos, escribió el manuscrito y realizó la aprobación final del manuscrito.

Correspondencia a Atsushi Kuwahara.

Este trabajo fue financiado por AMED con el número de subvención JP21bm0204002 (MT, SK) y por Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Sumitomo). KW, SY, T.Ka., HA, TT, YK, AN, KU, KO, MF, YH, AT, RH, OT, OO, HO, TH, AI, DN, KM, A.Ki. y A .Ku. son empleados de Sumitomo. T. Ki. es miembro de la junta de Sumitomo. SK tiene una función de consultoría científica para Sumitomo. MT y MM han recibido financiación para investigación de Sumitomo. Los autores son coinventores de solicitudes de patentes. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Communications Biology agradece a Biju B. Thomas y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Simona Chera y Eve Rogers.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Watari, K., Yamasaki, S., Tu, HY. et al. Autoorganización, control de calidad y estudios preclínicos de láminas de retina derivadas de iPSC humanas para la terapia de trasplante de tejidos. Comun Biol 6, 164 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04543-5

Descargar cita

Recibido: 23 agosto 2022

Aceptado: 31 de enero de 2023

Publicado: 10 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04543-5

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