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Aug 10, 2023

El polvo de hoja de neem (Azadirachta indica) mitiga el estrés oxidativo y las alteraciones patológicas desencadenadas por la toxicidad del plomo en la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9170 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Este estudio investigó los síntomas clínicos y patológicos de la toxicidad por plomo transmitida por el agua en tilapia silvestre del Nilo recolectada en un área contaminada con plomo (el Canal Mariotteya: Pb = 0,6 ± 0,21 mg L-1) y un pez de piscifactoría después de 2 semanas de exposición experimental al plomo. acetato (5–10 mg L−1) además de evaluar la eficacia del tratamiento con polvo de hoja de neem (NLP) para mitigar los síntomas de toxicidad por plomo. Se separaron un total de 150 peces (20 ± 2 g) en cinco grupos (30 peces/grupo con tres repeticiones). G1 se asignó como control negativo sin ningún tratamiento. Los grupos (2-5) fueron expuestos a acetato de plomo durante 2 semanas a una concentración de 5 mg L−1 (G2 y G3) o 10 mg L−1 (G4 y G5). Durante el período de exposición al plomo, todos los grupos se criaron en las mismas condiciones, mientras que G3 y G5 se trataron con 1 g L−1 de NLP. La toxicidad del plomo indujo la fragmentación del ADN y la peroxidación de lípidos y disminuyó el nivel de glutatión y la expresión de la enzima de síntesis de hemo delta aminolevulínico ácido deshidratasa (ALA-D) en tilapia salvaje, G2 y G4. La PNL pudo aliviar el estrés oxidativo estimulado por el plomo en G3 y mostró un efecto insignificante en G5. Los hallazgos patológicos, incluida la hiperplasia epitelial en las branquias, el edema en las branquias y los músculos, la degeneración y la necrosis en el hígado y los músculos, y la infiltración leucocitaria en todos los órganos, se correlacionaron directamente con la concentración de plomo. Así, la aplicación acuosa de NLP a 1 g L-1 redujo el estrés oxidativo y disminuyó las alteraciones patológicas inducidas por la toxicidad por plomo.

Se cree que la acuicultura es una forma práctica de reemplazar y conservar las poblaciones sobreexplotadas y las especies de peces en peligro de extinción, así como para cerrar la brecha entre la producción y la demanda humana1,2,3. La acuicultura ha aumentado significativamente la cantidad de productos del mar producidos desde la década de 1970, pero aún existen varios desafíos para la industria. Una variedad de factores interrelacionados, tales como el ambiente acuático, la nutrición y el stock de cultivo, influyen en la eficacia con la que operan las operaciones acuícolas. La acuicultura sostenible se basa en maximizar estas variables4. El empleo de técnicas sostenibles y respetuosas con el medio ambiente para aumentar la eficacia de la acuicultura y mitigar los factores ambientales estresantes se ha vuelto de interés recientemente5.

Durante mucho tiempo, los mejores métodos para aumentar el crecimiento, el desarrollo, la inmunidad y tratar infecciones fueron la quimioterapia y los antibióticos. Sin embargo, el uso continuado de la quimioterapia convencional en la acuicultura se vio limitado por una serie de consecuencias negativas sobre la inmunidad natural y la ecología de los peces6,7. Los enfoques ecológicos se han puesto a disposición del sector de la acuicultura como una alternativa8,9,10,11. Las enzimas exógenas, los microorganismos benéficos y las plantas medicinales son las tácticas ideales para la salud y producción de los organismos acuáticos12,13,14,15. El medio acuático es un sumidero de muchos contaminantes ambientales16,17,18. El plomo es un elemento no fundamental que ingresa al ecosistema acuático desde diversas fuentes, como la minería y los procesos industriales19,20. El plomo es un metal redox inactivo que puede acumularse en los tejidos y órganos de los organismos acuáticos y puede persistir en el agua y los sedimentos durante mucho tiempo21,22,23. El estrés oxidativo es el mecanismo central de la toxicidad estimulada por plomo. El aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) más allá de la capacidad del sistema antioxidante origina la peroxidación de lípidos en las membranas celulares de varios órganos, oxidación de proteínas y ADN, desactivación de enzimas, alteraciones en la expresión génica y alteraciones en el estado redox celular24,25. Las estructuras del sistema antioxidante en el pescado comprenden enzimas y antioxidantes de bajo peso molecular26. La superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), la glutatión peroxidasa (GPx) y la glutatión-s-transferasa (GST) son las principales enzimas antioxidantes y sirven como marcadores cruciales del estrés oxidativo2,4,27. Además, las reducciones en el glutatión (GSH) y el disulfuro de glutatión oxidado (GSSG) desempeñan una función crucial en la defensa antioxidante no enzimática28. El plomo modifica el sistema hematopoyético al inhibir la síntesis de hemoglobina y restringir enzimas esenciales en la vía de síntesis del hemo. También reduce la vida útil de los eritrocitos circulantes al aumentar la fragilidad de las membranas celulares29. El plomo regula a la baja tres enzimas clave necesarias para sintetizar el hemo, la más destacada es la deshidratasa del ácido aminolevulínico delta (ALA-D), también identificada como porfobilinógeno sintasa. ALA-D es una enzima citosólica que cataliza la segunda fase de la síntesis de hemo al formar porfobilinógeno a partir del ácido delta-aminolevulínico (ALA)30,31. Aunque ALA-D se expresa en todos los tejidos, los eritrocitos y el hígado tienen los niveles de expresión más altos32,33. La regulación a la baja o inactivación de la enzima ALA-D se emplea clínicamente para medir el nivel de toxicidad del plomo29,34,35. La contaminación del agua produce varios cambios patológicos en el tejido de los peces, cuya gravedad puede estar asociada con el grado de contaminación del agua36,37. Los dos órganos más afectados son las branquias, que entran en contacto directo con los contaminantes del agua, y el hígado, que interviene en la desintoxicación. La bioacumulación de metales pesados ​​también puede afectar a otros órganos38,39,40.

La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) es el pez de agua dulce cultivado más consumido en Egipto10,40,41. El Canal Mariotteya es un cuerpo de agua contaminado con metales pesados42. La tilapia cultivada en este sitio contaminado se considera un bioindicador adecuado de contaminación por metales y presenta un riesgo potencial para el bienestar humano21,22,23. Una reducción eficiente del plomo al menos por debajo del nivel reglamentario en las aguas residuales domésticas e industriales es significativa. La adsorción de metales pesados ​​por materiales agrícolas ha sido ampliamente explorada43. Neem (Azadirachta indica) es una planta terapéutica prometedora que controla a los depredadores de peces y trata muchas enfermedades bacterianas y parasitarias de los peces. Tiene capacidad adsorbente para diversos metales como el plomo y el cadmio44,45,46. Las materias primas vegetales (hojas) se cosechan y se aplican inmediatamente o después del secado y la molienda. Una forma sencilla de preparar el extracto acuoso de neem es remojar el material vegetal en agua. El polvo de hoja de neem crudo (NLP) y su extracto acuoso exhiben más beneficios en animales y peces en lugar de efectos dañinos47. Bhattacharyya y Sharma44 encontraron que 1,2 g L−1 de NLP podían eliminar hasta el 93 % del plomo en 96 h de una solución de 300 mg L−1 utilizando la tecnología de adsorción por lotes.

Este estudio exploró la influencia del plomo en el estado de salud de los peces mediante la estimación de la bioacumulación de plomo en varios tejidos y la evaluación del estrés oxidativo en el hígado, las branquias y los músculos de O. niloticus, lo que refleja la contaminación por metales del medio ambiente acuático. También realizamos una evaluación histopatológica de órganos de peces recolectados de un sitio naturalmente contaminado y con toxicidad experimental inducida por plomo, refiriéndose explícitamente al papel potencial de la exposición acuosa del polvo de hojas de neem en la reducción de la toxicidad por plomo.

Se recolectaron muestras de agua superficial y de tilapia silvestre del Nilo del canal Mariotteya en Giza, Egipto, que sufre graves problemas de contaminación biológica y química debido a una entrada masiva de desechos domésticos, agrícolas e industriales sin tratar42. Se recogieron tres muestras de agua en botellas de vidrio limpias (volumen de 1 L) 30 cm por debajo de la superficie del agua. Se recolectaron un total de diez tilapias silvestres del Nilo con un peso corporal promedio de 200 ± 30 g de la misma área y se transportaron en una caja de hielo al laboratorio. Los peces se diseccionaron para obtener muestras de hígado, branquias y músculo. El análisis de concentración de plomo se realizó en el agua y en parte de las muestras de tejido el día del muestreo. Partes de los tejidos se mantuvieron a -80 °C para evaluar biomarcadores oxidantes/antioxidantes, genotoxicidad y expresión génica; otro se utilizó para la evaluación histopatológica.

Las muestras de agua se mezclaron con ácido nítrico, se purificaron a través de un filtro de vidrio y se analizaron con un espectrofotómetro atómico (Modelo 3100, Perkin-Elma, Norwalk, CT, EE. UU.). Las muestras de tejido se deshidrataron a 105 °C durante 12 h, se quemaron a 550 °C durante 16 h en un horno de mufla, se digirieron con ácido (HNO3) y se diluyeron con agua desionizada hasta un volumen establecido utilizando el procedimiento de ceniza seca recomendado por Omar. et al.48. La concentración de plomo en los tejidos de los peces se indicó en mg kg−1.

Se recolectaron hojas maduras de A. indica del Centro de Investigación Agrícola, Egipto. Las hojas se lavaron minuciosamente para eliminar el polvo y las impurezas y luego se secaron a temperatura ambiente y en estufa a 50 °C durante 3 días. Las hojas secas se trituraron y tamizaron para recolectar el polvo fino de hoja de neem (NLP). El polvo se lavó con agua purificada para eliminar el pigmento y la turbidez, se volvió a secar y se almacenó en un frasco de vidrio como biosorbente46. El NLP se analizó utilizando una columna capilar directa TG-5MS y un espectrómetro de masas GC-TSQ (Thermo Fisher Scientific, Austin, TX, EE. UU.), y se determinó la composición química del extracto etanólico de neem. La temperatura del horno de columna se mantuvo inicialmente a 60 °C, se expandió a 250 °C a 6 °C min−1, se mantuvo durante 1 min y luego se elevó a 300 °C a 30 °C min−1. La temperatura del inyector se mantuvo a 270 °C. Se utilizó helio puro como gas portador a un caudal constante de 1 ml min−1. Con un Automuestreador AS3000 y GC en modo dividido, se inyectaron automáticamente muestras diluidas de 1 µl con un retraso de solvente de 4 min. En el modo de barrido completo, los espectros de masas EI que cubren el rango m/z de 50–650 se recopilaron a voltajes de ionización de 70 eV.

Se compraron un total de 150 machos monosexuales de O. niloticus con un peso de 20 ± 2 g y dos meses de edad en una piscifactoría privada en la gobernación de Sharkia, Egipto. Se distribuyeron en 15 acuarios de vidrio (40 × 30 × 100 cm) con un volumen total de 60 L de agua. Dos semanas después de la aclimatación, los peces se distribuyeron en cinco grupos (30 peces/grupo con tres repeticiones). G1 se asignó como control negativo sin ningún tratamiento. Los grupos (2-5) fueron expuestos a acetato de plomo disuelto en agua de crianza durante dos semanas a una concentración de 5 mg L−1 (G2 y G3) o 10 mg L−1 (G4 y G5)49. Durante el período de exposición al plomo, todos los grupos se criaron en las mismas condiciones, mientras que G3 y G5 se trataron con 1 g L−1 de NLP44 (Fig. 1). Al final de la prueba, se sacrificaron cinco peces por acuario con Ictyoclove® (Francia) para la recolección de tejido (hígado, branquias y músculo).

Esquema del experimento.

La peroxidación de lípidos se midió determinando la cantidad de malondialdehído (MDA) (mM g-1 de proteína) usando el ensayo de Sustancias Reactivas del Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)50. La reducción de glutatión (GSH) (proteína mM g-1) se evaluó según Ellman51. La absorbancia de los colores producidos se midió usando un espectrofotómetro UNICO-UV-2100.

La fragmentación del ADN fue detectada por difenilamina. El color azul formado se cuantificó a 578 nm usando un espectrofotómetro UNICO-UV-2100. El porcentaje de fragmentación de ADN se expresó como % de fragmentación de ADN = (OD sobrenadante/O. D sobrenadante + OD sedimento) × 10052.

Se recogieron muestras de tejido del hígado, las branquias y los músculos en una solución de triazol para medir la expresión génica. El ARN total se extrajo utilizando un mini kit de ARN QIAmp (Qiagen, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración y la pureza de las muestras de ARN total se comprobaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000. Para cada muestra, se produjo cDNA utilizando un kit de reactivos PrimeScript RT (Takara, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó una PCR basada en SYBR Green en un termociclador automatizado (Bio-Rad) en un volumen de 25 µL que comprendía 2 µL de solución de ADNc, 12,5 µL de SYBR Premix Ex Taq (Takara), 1 µL de cebador (10 µmol L−1) (Tabla 1) y 8,5 µL ddH2O. La reacción de ciclado se completó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante mediante PCR estándar de dos pasos. Los valores experimentales de Ct se normalizaron a GAPDH como un gen de mantenimiento y se calculó la expresión relativa de ARNm en comparación con una muestra de control. Cada ensayo incluyó muestras por triplicado para cada ADNc analizado y control negativo sin plantilla; la expresión relativa al control se evaluó mediante el método 2−ΔΔCT53.

Se recogieron muestras de tejido de branquias, hígado, riñones, bazo, cerebro y músculos de peces salvajes y de hígado, branquias y músculos de peces experimentales y se fijaron en tampón de formalina neutra al 10%. A continuación, las muestras fijadas se trataron con la práctica de inclusión en parafina, se seccionaron con un micrótomo alemán Leica 2135 en secciones de 3–4 µm de espesor y se tiñeron con tinción H&E. Se realizó un sistema de puntuación semicuantitativo de lesiones en peces experimentales. Una puntuación de 0 indicaba la ausencia de lesiones, 1 indicaba lesiones leves (1–25 % del tejido afectado), 2 indicaba lesiones moderadas (25–50 % del tejido afectado) y 3 demostraba lesiones graves (51 %–100 % de tejido afectado).

La evaluación estadística se completó mediante ANOVA unidireccional en SPSS versión 21. Las puntuaciones de lesiones microscópicas se analizaron estadísticamente mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba U de Mann-Whitney. Las puntuaciones de las lesiones se presentan en un diagrama de caja. Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos.

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (Vet CU 01122022596—Fecha de aprobación: 12/01/2022) y el comité ético de la facultad de agricultura de la Universidad de Tanta aprobaron el protocolo experimental y todos los métodos en el presente estudio para tratar animales con fines científicos (Aprobación No. AY2019-2020/Sesión 6/2020.01.13). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Nuestro informe de investigación con animales sigue las recomendaciones de las pautas ARRIVE. Los materiales vegetales utilizados en este estudio se recolectaron, examinaron e identificaron botánicamente en la Facultad de Agricultura del Desierto, Universidad Internacional Rey Salman, Egipto, siguiendo las pautas institucionales y la legislación (Número de muestra de comprobante: Neem/DA-1/2023).

El agua recolectada del Canal Mariotteya estaba contaminada con un alto nivel de plomo (Tabla 2). El nivel medio de plomo fue de 0,6 ± 0,21 mg L−1 (P ˂ 0,01), muy por encima del límite permisible (0,05 ppm). Las tasas de bioacumulación de plomo fueron significativamente elevadas en el hígado, las branquias y los músculos de O. niloticus del Canal Mariotteya.

La concentración de peroxidación de lípidos en todos los tejidos de G2 aumentó sustancialmente en comparación con el grupo de control, mientras que en G3 disminuyó significativamente a valores cercanos al control. Además, todos los tejidos de tilapia silvestre demostraron una concentración significativamente elevada de MDA en comparación con el control experimental y G2, excepto en las branquias, donde las concentraciones de plomo fueron estadísticamente insignificantes. La exposición a 1 g L−1 de NLP no mitigó los efectos peligrosos de la alta concentración de acetato de plomo en G5 (Fig. 2).

Concentración de MDA (mM g-1 de proteína) en tejidos de tilapia experimental y silvestre. Las barras con superíndices únicos difieren en (P < 0,05).

El nivel de GSH en el tejido hepático de G3 se incrementó significativamente en comparación con G2, sin alteraciones significativas en otros tejidos del mismo grupo. Sin embargo, el contenido de GSH en todos los tejidos silvestres fue sustancialmente mayor que el de nuestros grupos de tratamiento (G2, G3, G4 y G5) e inferior al del control (G1) (Fig. 3).

Concentración reducida de glutatión (mM g-1 de proteína) en tejidos de tilapia experimental y silvestre. Las barras con letras diferentes se alteran en (P < 0,05).

El porcentaje de fragmentación del ADN en todos los tejidos de G2 aumentó significativamente en comparación con el grupo de control, pero disminuyó significativamente en el hígado, las branquias y los músculos de G3 en comparación con G2. La adición de 1 g L-1 de NLP no redujo el efecto genotóxico de 10 mg L-1 de acetato de plomo en G5. Mientras tanto, el porcentaje de fragmentación de ADN en todos los tejidos de tilapia salvaje fue significativamente mayor que en el control (Fig. 4).

% de fragmentación de ADN en tejidos de tilapia del Nilo experimental y salvaje. Las barras mostraron diferentes superíndices alterados en (P < 0,05).

El gen ALAD se sobreexpresó significativamente en G3 en 3, 2 y 1,8 veces en el hígado, las branquias y el músculo, respectivamente, en comparación con otros grupos de tratamiento. La expresión del gen ALAD se reguló a la baja en todas las muestras de tejido de G2, G4, G5 y tilapia salvaje en comparación con el control (Fig. 5).

RT-PCR cuantitativa de la expresión del gen ALA-D de varios grupos y tilapia silvestre. ( a ) Evaluación de la expresión del gen ALA-D en el hígado, branquias y órganos musculares en varios grupos y tilapia salvaje en comparación con el control. Los valores se expresan como medias ± SE; n = 5. Las barras que llevan * son diferentes en P < 0,05. (b) Gel recortado de movilidad electroforética de productos de RT-PCR cuantitativa de genes ALA-D y GAPDH (control interno) en gel de agarosa al 2%. Carril 1 = G1; carril 2 = G3; carril 3 = G2; carril 4 = G5; carril 5 = G4; Carril 6 = tilapia salvaje.

Las muestras de pescado del Canal Mariotteya mostraron lesiones variables en diferentes órganos. La microscopía de las branquias reveló aneurismas en las puntas de las laminillas branquiales secundarias, hipertrofia epitelial severa e infiltración leucocitaria masiva en las laminillas branquiales primarias (Fig. 6a), además de áreas de hiperplasia severa de células epiteliales y mucosas, con una fusión de laminillas branquiales secundarias. (Figura 6b). Se observaron infestaciones parasitarias en las branquias, incluidas metacercarias enquistadas de tamaño variable encerradas en cápsulas de tejido conjuntivo fibroso y rodeadas de células granulares eosinofílicas (EGC) y células mononucleares en el cartílago branquial. El cartílago branquial estaba distorsionado, necrosado y fragmentado (Fig. 6c). La epiteliocistis solitaria, una agregación de bacterias en el epitelio branquial, se observó con poca frecuencia en el epitelio branquial (Fig. 6d). La microscopía de los músculos mostró diferentes infestaciones parasitarias identificadas en base a su apariencia morfológica. Había metacercaria enquistada acompañada de mínima reacción tisular y quistes parasitarios dentro de los haces musculares (Myxobolus spp.) junto con atrofia y degeneración de los haces musculares (Fig. 6e). Además, entre las fibras musculares se observaron múltiples parásitos redondeados de color púrpura de tamaño variable (Ichthyphonus spp.) (Fig. 6f). La microscopía hepática mostró infiltración de EGC en el área del portal además de células necróticas solitarias, que presentaban cariopicnosis (Fig. 6g). Destacaba EGC en la cápsula del hepatopáncreas, junto con infiltración de algunos melanomacrófagos en el hepatopáncreas. La microscopía cerebral reveló manguitos linfocíticos perivasculares y áreas difusas y focales de gliosis (Fig. 6h). También mostró degeneración neuronal y meningitis con infiltración leucocitaria. La microscopía renal reveló hinchazón del epitelio tubular con estrechamiento de la luz y células necróticas que mostraban cariopicnosis (Fig. 6i). También se observaron múltiples granulomas con tejido necrótico rodeado de melanomacrófagos, células mononucleares y cápsulas fibrosas (Fig. 6j). Se observaron metacercarias enquistadas rodeadas de cápsulas fibrosas y EGC (Fig. 6k). En cuanto al bazo, hubo activación de los centros de melanomacrófagos (Fig. 6l).

(a–d) Branquias, Oreochromis niloticus. (a) Presencia de aneurisma en los vasos sanguíneos laminares en las puntas de las laminillas branquiales secundarias, hiperplasia epitelial, infiltración de células inflamatorias y degeneración cartilaginosa. (b) Hiperplasia grave de células epiteliales y mucosas, fusión de laminillas branquiales secundarias e infiltración de células inflamatorias. ( c ) Presencia de metacercaria enquistada en el cartílago de las laminillas branquiales primarias. (d) Presencia de epiteliocistis además de infiltración celular inflamatoria grave, incluidas células granulares mononucleares y eosinofílicas. (e,f) Músculo. (e) Presencia de quiste parasitario dentro de los haces musculares (Myxobolus spp.) junto con atrofia y degeneración de los haces musculares. f) Presencia de múltiples parásitos redondeados de tamaño variable entre las fibras musculares (Ichthyphonus spp.) (tinción H&E, ×400). (g) Hígado y (h) cerebro de Oreochromis niloticus. ( g ) Infiltración de células granulares eosinofílicas en el área del portal y necrosis de hepatocito solitario con cariopicnosis (tinción H&E, × 400). ( h ) Manguito linfocítico perivascular y gliosis extensa (tinción H&E, × 200). (i–k) Riñón y (l) bazo de Oreochromis niloticus. (i) Hinchazón del epitelio tubular renal y estrechamiento de la luz. (j) Granuloma rodeado de delicado tejido fibroso y melanomacrófagos. ( k ) Metacercaria enquistada subcapsular rodeada de células granulares eosinofílicas (tinción H&E, × 400). (l) Activación de centros de melanomacrófagos en el bazo (tinción H&E, ×200).

En el estudio experimental, la exposición al plomo causó lesiones histopatológicas en las branquias, el hígado y los músculos de los peces, y su gravedad se intensificó con el aumento de la concentración de plomo. La microscopía de branquias en el grupo de control reveló estructuras histológicas normales (Fig. 7a), mientras que en G2 mostró hipertrofia epitelial, levantamiento epitelial, infiltración de leucocitos y edema en las laminillas branquiales primarias (Fig. 7b). Estas lesiones disminuyeron en G3 expuesto a neem en agua (Fig. 7c). En G4 expuesto a una alta concentración de plomo, se registró edema severo y necrosis epitelial y cartilaginosa en las láminas branquiales primarias (Fig. 7d), en comparación con edema leve e hipertrofia epitelial en G5 (Fig. 7e). Las puntuaciones de lesiones microscópicas en las branquias no mostraron una diferencia significativa entre los grupos, excepto en el edema y la infiltración leucocitaria, que fueron significativamente menores en G3 que en G2 (Fig. 8).

(a-e) Branquias, (f-j) hepatopáncreas y (k-o) músculo de Oreochromis niloticus. (a) Estructura histológica normal en G1. (b) Hipertrofia epitelial de las laminillas branquiales, infiltración de células inflamatorias y edema en las laminillas branquiales primarias en G2 en comparación con (c) disminución del edema en G3. (d) Edema severo y necrosis del cartílago en las láminas branquiales primarias en G4 en comparación con (e) edema leve e hipertrofia epitelial en G5. (f) Estructura histológica normal en G1. ( g ) Degeneración vacuolar severa, cariopicnosis y necrosis de hepatocitos en G2, ( h ) que disminuyó en G3. (i) Necrosis masiva de hepatocitos con cuerpos hialinos intracitoplasmáticos y disociación de hepatocitos en G4, (j) que disminuyó en G5. ( k ) Estructura histológica normal en G1. (l) Degeneración y separación de las fibras musculares con atrofia y necrosis de los haces musculares y algunas infiltraciones leucocitarias en G2. (m) Edema leve y desintegración de algunos haces musculares en G3. (n) Necrosis y pérdida de fascículos musculares en G4. (o) Separación y vacuolización de miofibrillas en G5 (tinción H&E, ×200).

Boxplot de las puntuaciones histopatológicas. ( a - c ) Puntuaciones de lesiones branquiales. (d-f) Puntuación de lesión hepática. (g-k) Puntuaciones de lesiones musculares. Los recuadros representan el rango intercuartílico (RIC). Las líneas medias gruesas son las medianas. Los valores máximo y mínimo están representados por finas líneas horizontales en la parte superior e inferior.

La microscopía de hepatopáncreas mostró estructura histológica típica en G1 (Fig. 7f) pero reveló degeneración vacuolar severa, cariopicnosis y necrosis moderada de hepatocitos en G2 (Fig. 7g), que estaba disminuida en G3 (Fig. 7h). En G4, hubo áreas masivas de necrosis de hepatocitos, necrosis de hepatocitos solitarios, cuerpos hialinos eosinofílicos intracitoplasmáticos y disociación de hepatocitos además de necrosis de las células pancreáticas (Fig. 7i). Se observaron menos lesiones en G5 (Fig. 7j). Las puntuaciones de lesiones hepáticas mostraron una diferencia significativa entre los grupos. La necrosis y la degeneración hepática se redujeron considerablemente en G3 en comparación con G2 y G5 en comparación con G4, pero no significativamente (Fig. 8).

La microscopía muscular en los grupos de tratamiento mostró más lesiones que G1, que tenía una estructura histológica normal (Fig. 7k). G2 mostró degeneración, separación de fibras musculares, atrofia y necrosis de haces musculares y algunas infiltraciones leucocitarias (Fig. 7L). Por el contrario, los músculos G3 tenían edema leve y desintegración de algunos haces musculares (Fig. 7m). En G4, la necrosis y la pérdida de fascículos musculares fueron más evidentes que con la dosis más baja (Fig. 7n). En G5 hubo separación y vacuolización de miofibrillas, que fue menos severa que en el grupo anterior (Fig. 7o). La gravedad de la degeneración, la necrosis, la atrofia y el edema muscular aumentó significativamente con la exposición al plomo en G2 y G4 en comparación con el control. La necrosis muscular, la atrofia y la infiltración leucocitaria se redujeron significativamente en G3 pero no en G5 (Fig. 8).

La estructura química del biosorbente influye en el proceso de adsorción de metales. La adsorción de iones metálicos ocurre debido a la interacción de los grupos funcionales reactivos del biosorbente. Los componentes fitoquímicos del extracto de hoja de neem son alcaloides, carbohidratos, azúcares reductores, flavonoides, glucósidos, taninos, compuestos fenólicos y saponinas (Archivo complementario). Los resultados de GC-MS mostraron la presencia de 38 compuestos. El nepetalactol (isocalamendiol) fue el más alto en este extracto a TA 9,76 (9,39 %), seguido del acetato de 7-metil-Z-tetradecen-1-ol a TA 10,66 (7,59 %), ácido etanimidotoico a TA 5,33 (6,92 %), sarrerosido a TA 15,87 (6,48 %), amida de d-gala-l-ido-octónica a TA 7,05 (6,27 %), óxido de ledeno-(II) a TA 14,29 (6,01 %), esteviósido a TA 6,77 (5,92 %), carofileno óxido a TA 17,16 (4,78 %), 1,3,5-triazina-2,4-diamina a TA 11,75 (3,99 %), tridecanedial a TA 6,30 (3,92 %) y otros compuestos diversos de cadena larga (38,73 %) .

Las concentraciones de metales pesados ​​en cuerpos de agua cercanos a áreas industriales y las especies acuáticas que habitan dichos lugares han sido estudiadas para evaluar el grado de contaminación54. Se encontró que la concentración de plomo en el Canal Mariotteya excedía el límite permisible recomendado por la FAO42, que es similar a la concentración registrada en el presente ensayo. La toxicidad de concentraciones subletales de plomo en varios órganos está mediada principalmente por la producción elevada de ROS, que posteriormente provoca la oxidación de biomoléculas y alteraciones patológicas.

La distribución del plomo en los órganos de tilapia salvaje que examinamos fue en el siguiente orden: hígado ˃ branquias ˃ músculo. La mayor concentración de plomo (11,08 ± 2,3 mg kg−1) se presentó en el hígado, mientras que la menor se encontró en los músculos (4,69 ± 1,2 mg kg−1). Por el contrario, la mayor concentración de plomo se detectó en las branquias de C. gariepinus, O. niloticus y trucha arcoíris55. Esto podría deberse a la diferencia en el tiempo de exposición, la concentración de plomo en el ecosistema acuático, el mecanismo de adaptación de las branquias y la naturaleza bioacumulativa del hígado.

La fragmentación de MDA, GSH y ADN son valiosos biomarcadores del estrés oxidativo desencadenado por plomo en animales acuáticos56. En el presente trabajo, el porcentaje de fragmentación de ADN y la concentración de MDA (mM g-1 de proteína) en todos los tejidos de peces después de la exposición al plomo aumentaron significativamente, mientras que disminuyeron significativamente en todos los tejidos en G3. Además, la concentración de GSH se redujo significativamente en los tejidos de todos los grupos de plomo, pero aumentó drásticamente en el hígado de G3 en comparación con G2, lo que indica que 1 g L-1 de NLP podría proteger a los peces contra 5 mg L-1 de daño oxidativo inducido por plomo, pero no frente a 10 mg L−1 de plomo. Nuestros resultados demostraron que la concentración de GSH en diferentes tejidos de tilapia del Nilo Mariotteya fue sustancialmente mayor que en los grupos expuestos al plomo. Estos resultados coincidieron con Shaukat et al.19, quienes notaron un aumento significativo en la actividad de la peroxidasa en el hígado y las branquias de Labeo rohita después de la exposición al plomo. Este hallazgo se puede atribuir a las defensas naturales, los mecanismos adaptativos y la acción compensatoria de las enzimas antioxidantes en diferentes tejidos frente a la toxicidad inducida por radicales libres57. Zhang et al.58 afirmaron que el estrés oxidativo intensivo podría aumentar y activar la expresión génica que codifica enzimas antioxidantes para iterar el desequilibrio causado por el daño oxidativo.

Los niveles de MDA aumentaron en los cerebros de Clarias batrachus después de 60 días de exposición al plomo59, así como en Cyprinus carpio L., Oncorhynchus mykiss Walbaum y Acipenser baeri Brandt spp., y la actividad de SOD se redujo60. Además, los niveles totales de GSH y GSH/GSSG disminuyeron después de 7 días de exposición al plomo en el hígado de peces de agua dulce O. niloticus61. Zhang et al.58 atribuyeron la alteración del mecanismo adaptativo de GSH en el hígado del pez dorado Carassius auratus al alto consumo de GSH, lo que resultó en una reducción de la relación GSH/GSSG. Otros estudios de exposición al plomo han informado una reducción significativa en los niveles de GSH, SOD, GST y CAT en el hígado de Clarias gariepinus y O. niloticus62. El plomo provoca un aumento significativo de la actividad de GPX en el hígado de O. niloticus61,63 y en el cerebro de Clarias batrachus59. Estos resultados indican que el plomo podría causar daño oxidativo a la célula a través de la producción de ROS por mecanismos de tipo Haber-Weiss y Fenton que posteriormente inducen la peroxidación de lípidos, modificaciones de proteínas y daño en el ADN63. Además, la elevación de MDA reacciona con los grupos amino de las proteínas y otras biomoléculas para producir una variedad de aductos64. Estos aductos incluyen productos entrecruzados65 y aductos con bases de ADN que son mutagénicos66 y cancerígenos67.

La supresión de la síntesis de hemo es uno de los impactos significativos del plomo. El plomo inhibe la actividad de ALAD mediante la unión del grupo sulfhidrilo (SH), que se requiere para una actividad enzimática óptima68, o desplaza un ion de zinc en la posición de unión al metal que posteriormente alterna la estructura cuaternaria de las enzimas69. En el presente análisis, la expresión del gen ALA-D se redujo significativamente en el hígado, las branquias y los músculos de la tilapia del Nilo salvaje y experimental sujeta a diferentes concentraciones de plomo. Estos resultados coincidieron con los de Li et al.70, quienes demostraron que la exposición al plomo en el agua da como resultado una regulación a la baja de la transcripción de ALA-D. Una alta concentración de plomo en el hígado de Palaemonetes turcorum se correlaciona con la inhibición de la enzima ALA-D71. También se reportó un alto nivel de plomo en el hígado y muestras de sangre de Prochilodus lineatus recolectadas de cuerpos de agua contaminados en Buenos Aires y La Plata con depleción de la actividad de ALA-D72. ALA-D se considera un biomarcador específico para la exposición al plomo debido a las correlaciones negativas entre la concentración de plomo en sangre y la inhibición de ALA-D en especies de peces73 y tejidos de invertebrados de agua dulce74.

Como consecuencia de la inhibición de ALA-D, δ-ALA se acumula en la sangre y estimula la generación de ROS75, lo que resulta en estrés oxidativo76. Además, el daño oxidativo del ADN debido a la acumulación de ALA ocurre a través de la oxidación de ALA a ácido 4,5-dioxovalérico, un agente alquilante eficiente de los restos de quinina tanto en los nucleósidos como en el ADN77. Del mismo modo, la acumulación de ALA da como resultado la sobreproducción de 8-oxo-7, 8-dihidro-2-desoxiguanosina y 5-hidroxil-2-desoxicitidina incriminados en el daño del ADN inducido por ALA78 a través de la interacción con sitios de unión de zinc en el ADN- proteína asociada protamina79. Además, el plomo induce neurotoxicidad porque el ALA es estructuralmente similar al ácido γ-aminobutírico, estimulando los receptores de ácido γ-aminobutírico en el sistema nervioso69. En el presente estudio, la depresión de la expresión del gen ALA-D en diferentes tejidos se consideró un biomarcador importante relacionado con la contaminación ambiental.

La exposición de los peces a metales puede inducir fallas en el funcionamiento del sistema inmunitario, lo que aumenta la tasa de mortalidad80. El plomo generalmente daña el sistema inmunológico de los peces y los hace más vulnerables a las infecciones, como sugirieron Paul et al.81. Los peces expuestos a 9,4 mg L-1 de acetato de plomo durante 4 días mostraron una reducción en la actividad fagocítica y el índice fagocítico después del desafío con S. aureus, inhibición de sustancias antimicrobianas como el óxido nítrico (NO) y mieloperoxidasa (MPO), daño severo en el epitelio intestinal y la regulación a la baja en la transcripción de TNF-α. En el estudio actual, se observaron granulomas con un área central de necrosis y cápsula fibrosa en varios órganos, y estos provocaron una respuesta inflamatoria circundante. Aunque hay poca información disponible sobre las bacterias que causan la formación de granulomas en la tilapia en Egipto, en otros países se han informado una amplia gama de infecciones bacterianas. Muchas causas de formación de granulomas han sido implicadas y reportadas en la tilapia. Streptococcus agalactiae puede causar inflamación granulomatosa en los ovarios y testículos82. La infección crónica de Pseudomonas spp. provoca granulomas de tejido epitelioide y necrótico encapsulado83. Además, la inflamación granulomatosa está relacionada con Francisella noatunensis subsp. orientalis en tilapia cultivada (O. niloticus y O. aureus) en China84.

En el presente trabajo, el plomo provocó diversas lesiones en las branquias similares a las reportadas previamente85. Las lesiones musculares, como la separación de los haces musculares y la reducción de la compacidad, también fueron registradas previamente86. Además, típicamente se observan lesiones hepáticas como inclusiones citoplasmáticas, hinchazón, degeneración hidrópica y necrosis87. Para disminuir el efecto patológico de la toxicidad del plomo, la planta de neem es un posible candidato que puede eliminar el plomo del agua, reduciendo así sus efectos tóxicos. Neem tiene muchas propiedades farmacológicas que pueden mejorar la calidad del agua88,89. El estudio actual muestra que agregar neem al agua puede reducir las lesiones patológicas en varios órganos inducidas por la toxicidad del plomo. Esto fue muy evidente en G3 pero no en G5 expuesto a la alta concentración de plomo, lo que podría deberse a la saturación del neem por plomo en G5. Bhattacharyya y Sharma44 encontraron que 1,2 g L−1 de NLP podían eliminar hasta el 93 % del plomo en 96 h de una solución de 300 mg L−1 utilizando la tecnología de adsorción por lotes. La absorción mejoró constantemente en el rango de pH de 2 a 7, más allá del cual la adsorción no pudo llevarse a cabo debido a la precipitación del metal. La adsorción de cationes metálicos depende de la naturaleza de la superficie adsorbente, la distribución del catión metálico y el pH del sistema. Dependiendo del pH de la solución, los grupos funcionales orgánicos en la superficie del adsorbente pueden cargarse positiva o negativamente. La superficie del carbón activado se carga negativamente a valores de pH superiores a pHzpc (carga de punto cero) debido a la ionización de los grupos superficiales ácidos de carbono-oxígeno, y los grupos superficiales exhiben una potente atracción electrostática hacia las especies metálicas. Al analizar la cromatografía del extracto de árbol de neem utilizando GC-Ms, el extracto contenía muchos grupos funcionales aromáticos, alifáticos y de carbono orgánico de cadena larga. Las propiedades de estos compuestos deben evaluarse en el futuro. Los compuestos aromáticos contienen grupos centrales activos como hidroxilo (OH-) y cetonas (C=O) y contienen átomos de alta electronegatividad como nitrógeno (N2), azufre (S) y silicio (Si). Los compuestos heterocíclicos, incluidos los polisacáridos y los carbohidratos, tienen muchos centros activos y átomos electronegativos. Todos los grupos activos, átomos electronegativos, compuestos de polisacáridos, carbohidratos y átomos de oxígeno, en el caso del estado iónico, tienen ionización parcial que puede adsorber el elemento de plomo ionizado en solución, y esta adsorción es una adsorción tanto química como física90. La tendencia de coordinación de los electrones aromáticos para donar grupos que involucran grupos hidroxilo, éter y fenilo es muy superior a la de los grupos alifáticos correspondientes. La alta tendencia a la coordinación de derivados aromáticos proviene de su mayor densidad de electrones y su capacidad para participar en la conjugación. Esta conjugación alivia los complejos metálicos producidos. Como resultado, la tendencia de coordinación y formación de complejos de la lignina es mucho mayor que la de la celulosa y la hemicelulosa. Por lo tanto, la absorción de metales por NLP se puede vincular a su mayor contenido de lignina. Además, estudios previos han encontrado que el pH alcalino del ambiente acuático aumenta la disociación de los grupos funcionales como OH y fibra carbonosa C–OH, lo que en consecuencia aumenta la absorción de metales (eficiencia de adsorción) del biosorbente91.

El análisis químico de muestras de agua y órganos de peces recolectados del Canal Mariotteya mostró una alta concentración de plomo que excedía los límites permisibles de la FAO. La exposición crónica subletal al plomo en el ambiente acuático produce estrés oxidativo, efectos genotóxicos y diversas alteraciones patológicas en la tilapia del Nilo en este lugar. Las muestras de tejido (branquias, hígado y músculo) recolectadas de tilapia silvestre y tilapia experimental expuestas a 5–10 mg L-1 de acetato de plomo mostraron un aumento en la peroxidación lipídica y la oxidación del ADN, así como una reducción en los sistemas de defensa antioxidantes y el nivel de expresión de UN CHICO. Las lesiones patológicas se correlacionaron directamente con la concentración de plomo. El polvo de hojas de neem a 1 g L-1 mitigó el estrés oxidativo y las lesiones patológicas de la toxicidad del agua con acetato de plomo de 5 mg L-1 en un régimen de exposición estática.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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El primer autor quisiera agradecer a la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) y al Banco de Conocimiento Egipcio (EKB) por financiar el acceso abierto.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por The Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) en cooperación con The Egyptian Knowledge Bank (EKB).

Departamento de Medicina de Animales Acuáticos, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, Egipto

Nermeen M. Abu-Elala y Nehal A. Younis

Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Internacional Rey Salman, Sinaí del Sur, Egipto

Nermeen M. Abu Elala

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, 12211, Egipto

marwa s. khattab

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, 12211, Egipto

Huda O. Abu Bakr

Departamento de Inmunología, Instituto de Investigación en Salud Animal, Dokki, Giza, Egipto

Sameh Helmy

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad del Canal de Suez, Ismailia, 41522, Egipto

Ahmed Hisham

Medio Oriente para vacunas veterinarias (MEVAC), El-Salihya El-Gededa, 44671, El-Sharkia, Egipto

Ahmed Hisham

Departamento de Producción Animal, Facultad de Agricultura, Universidad Kafrelsheikh, Kafr El-Sheikh, 33516, Egipto

Mahmoud AO Dawud

The Center for Applied Research on the Environment and Sustainability, The American University in Cairo, Cairo, 11835, Egypt

Mahmoud AO Dawud

Facultad de Agricultura, Universidad de Tanta, Tanta, 31527, Egipto

Mohammed F. El Basuini

Facultad de Agricultura del Desierto, Universidad Internacional Rey Salman, Sinaí del Sur, 46618, Egipto

Mohammed F. El Basuini

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Todos los autores contribuyeron por igual a este manuscrito.

Correspondence to Mohammed F. El Basuini.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Abu-Elala, NM, Khattab, MS, AbuBakr, HO et al. El polvo de hojas de neem (Azadirachta indica) mitiga el estrés oxidativo y las alteraciones patológicas provocadas por la toxicidad del plomo en la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus). Informe científico 13, 9170 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36121-4

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Recibido: 10 enero 2023

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36121-4

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