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Sep 15, 2023

Una microperfusión y en

Informes científicos volumen 5,

Informes científicos volumen 5, Número de artículo: 18095 (2015) Citar este artículo

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Los espectrómetros ahora ofrecen las intensidades de campo necesarias para visualizar células de mamíferos, pero no fueron diseñados para acomodar imágenes de tejidos vivos. Como tal, los espectrómetros plantean importantes desafíos, el más evidente de los cuales son las limitaciones espaciales, para realizar experimentos en tejido vivo. Esta limitación se vuelve problemática al tratar de emplear equipos de perfusión comerciales que son voluminosos y, al estar diseñados casi exclusivamente para estudios de microscopía óptica o electrofisiología, rara vez incluyen la compatibilidad con RM como criterio de diseño. Para superar los problemas exclusivos de los entornos de campos magnéticos ultraelevados con acceso espacial limitado, hemos diseñado sistemas de microperfusión y oxigenación interna capaces de interactuar con la serie de microbobinas de superficie de Bruker. Estos dispositivos están diseñados para admitir imágenes de resolución celular en estudios de RM de tejido vivo extirpado. El sistema combinado permite un control preciso tanto del gas disuelto como de los niveles de pH en el perfundido, lo que demuestra su aplicabilidad en una amplia gama de tipos de tejidos. Su tamaño compacto, arquitectura lineal y contenido de material compatible con MR son características de diseño clave destinadas a proporcionar una interfaz de hardware versátil compatible con cualquier espectrómetro de RMN. Dichos atributos garantizarán la utilidad continua del equipo de microperfusión, ya que se puede utilizar con una multitud de sistemas de RMN contemporáneos además de los que están actualmente en desarrollo.

Existe un fenómeno clínico bien descrito y establecido que correlaciona el aumento de la eficacia del tratamiento de la enfermedad con la disminución del intervalo de tiempo entre el inicio de la enfermedad y la aplicación del tratamiento1,2,3. Desafortunadamente, la mayoría de los diagnósticos contemporáneos se basan en el autoinforme de la sintomatología de la enfermedad por parte del paciente antes de que los médicos presenten el diagnóstico y el tratamiento. Esto a menudo permite periodos de tiempo severamente prolongados de desarrollo de la enfermedad asintomática antes de que los pacientes reciban los tratamientos necesarios.

Si bien los ensayos de biomarcadores prometen proporcionar herramientas de detección exquisitamente sensibles capaces de detectar enfermedades de forma temprana, acortando así el intervalo de tiempo entre el inicio y el tratamiento, estas herramientas generalmente ofrecen poca información sobre las características espaciales de la patología tisular dentro del organismo vivo. La información precisa sobre las características espaciales del tejido enfermo no es trivial en el caso de la atención del paciente, ya que los médicos deben poder distinguir entre tejidos sanos y no sanos para una variedad de aplicaciones, incluida la confirmación del diagnóstico, el seguimiento de la enfermedad posterior al tratamiento y la planificación quirúrgica para la escisión del tumor4 . Alternativamente, los métodos de diagnóstico que pueden ofrecer información espacial específica del tejido, como el etiquetado molecular después de la biopsia de tejido, a menudo tienen un alcance demasiado limitado de sus datos espaciales, no se pueden medir repetidamente o cuando se investigan ciertos tejidos y con demasiada frecuencia dan como resultado infecciones secundarias que complicar o impedir la recuperación5. En los últimos años se ha producido un resurgimiento de las infecciones secundarias, especialmente en el caso de la biopsia de próstata, presumiblemente debido a una disminución continua de la eficacia de los antibióticos posoperatorios6,7.

Claramente, los métodos de imágenes clínicas deben desarrollarse junto con las mejoras realizadas en los métodos moleculares de detección de enfermedades si queremos aprovechar todo el potencial de cualquiera de las metodologías para mejorar la salud del paciente. La identificación de las características de la RM de los tejidos sanos y enfermos a nivel celular proporcionará una idea de cómo las condiciones de la enfermedad en etapa temprana, a menudo asintomática, afectan la señal de la RM y las características del contraste. Por lo tanto, si bien la microestructura del tejido actualmente es, y puede permanecer, inaccesible para la observación directa en la clínica, poseer una comprensión profunda de cómo los estados de enfermedad específicos afectan los parámetros de contraste de RM en el microambiente conducirá a una comprensión de cómo ocurren los cambios patológicos a nivel microscópico. presentarse en exploraciones clínicas. Dichos datos de resolución celular (<10 μm isotrópicos) deben recopilarse utilizando equipos de imágenes de campo ultraalto, ya que estos son los únicos sistemas capaces de cuantificar los parámetros de contraste de RM en la escala física relevante. Por lo tanto, existe una necesidad actual de sistemas de formación de imágenes por RM capaces de resolver la arquitectura celular de los mamíferos para su uso en estudios de caracterización de tejidos sanos y enfermos.

Los estudios preliminares de imágenes de RM de la estructura celular de los mamíferos se han realizado exclusivamente en muestras de tejido fijadas debido al largo tiempo de recolección necesario para producir escaneos de resolución celular8,9. Si bien estas condiciones experimentales fueron necesarias para garantizar la estabilidad de la muestra en el transcurso de largos experimentos de obtención de imágenes, dichas condiciones no son ideales ya que se sabe que el fijador altera las propiedades osmóticas de los tejidos, la permeabilidad de la membrana y las características de relajación10,11,12,13.

Los estudios de microscopía de RM realizados en explantes de tejido vivo han sufrido tradicionalmente una resolución baja, es decir, no celular, así como un control impreciso de las condiciones de perfusión en el sitio del tejido aislado. Desde entonces, la incapacidad de visualizar directamente la estructura celular se ha superado mediante grandes mejoras en la tecnología de microbobinas de radiofrecuencia (RF)14,15,16,17,18,19,20,21,22. Sin embargo, la capacidad de controlar eficazmente las condiciones de perfusión durante los experimentos de microimágenes de RM no se ha abordado adecuadamente. Numerosas iteraciones de dispositivos de perfusión están disponibles para estudios de explantes que ofrecen un excelente control de las condiciones de la muestra, así como características innovadoras, como conjuntos de microagujas, para mejorar la entrega de metabolitos23,24,25,26. Sin embargo, un inconveniente clave de la mayoría de los sistemas de perfusión contemporáneos es la falta de compatibilidad con la RM durante las etapas de concepto y diseño de su desarrollo. Como resultado, modificar dichos dispositivos para que puedan interactuar con los sistemas de imágenes de RM existentes es muy poco práctico dadas las limitaciones espaciales y materiales impuestas cuando se trabaja con escáneres de campo magnético ultraalto.

Para abordar la necesidad de hardware de microperfusión compatible con RM confiable para usar con explantes vivos, hemos diseñado y fabricado un sistema de perfusión/retención de tejidos específicamente para usar en estudios de resolución celular. El sistema prototipo interactúa con una bobina de microsuperficie comercialmente disponible modificada (Bruker Biospin, B6370). Además de esquemas detallados y procedimientos de fabricación, informamos los resultados de las pruebas que cuantifican el contenido de oxígeno disuelto y el pH de nuestro líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF), así como la estabilidad de la señal de RM a lo largo del tiempo en experimentos en los que se utiliza nuestro oxigenador interno. En el caso de la cuantificación del pH y del gas disuelto, los resultados de las pruebas que utilizan el oxigenador interno se comparan con experimentos equivalentes que emplean un dispositivo oxigenador de membrana externo de diseño anterior27.

Se modificó una microbobina de superficie de 500 μm de diámetro (Bruker Biospin, Z76409) para interactuar con la plataforma de microperfusión. Se hizo un canal (15 mm LN × 3 mm HT × 4 mm D) en la parte posterior del ensamblaje de plástico de la bobina. Se pegaron dos espaciadores de nailon (6 mm LN × 4 mm HT 0,5 mm W) que flanqueaban el canal y se limaron hasta el contorno semicircular de la bobina. Se extendieron dos ranuras bilaterales más estrechas (3 mm HT × 1,5 mm D) desde el canal hasta que envolvieron el ensamblaje de la bobina. Se perforó un orificio (2 mm de diámetro × 14 mm de profundidad) en la parte superior del ensamblaje de la bobina centrado a lo ancho y ubicado directamente detrás de la placa de astillas.

Se emplearon líneas de perfusión de alta retención de gas (Cole-Parmer, 06508-13) entre el depósito de perfusión gaseada y los oxigenadores. En la configuración del oxigenador externo, esta línea también unía el oxigenador y el pozo de perfusión. Una bomba peristáltica (Masterflex L/S, 7519-20) impulsó la perfusión (2 ml/min). Para la cámara de perfusión (volumen de 150 μm), la barra de acetal se mecanizó en una única configuración abierta (9,5 mm de DE, 6 mm de LN, 6 mm de DI). El extremo abierto se biseló 30o para acomodar una junta de silicona (Amazon, ORS-009-25) que se adhirió con sellador de silicona. Se fresa un canal horizontal (2,5 mm HT × 1 mm D) en el extremo cerrado del pozo de perfusión para acomodar una brida para cables (Thomas & Betts, SF100-18). Las líneas de entrada y salida (Cole-Parmer, S-06418-02) se mantuvieron en su lugar con uretano y se desplazaron (3 mm) dentro del interior del pozo para maximizar el flujo turbulento y minimizar los gradientes de metabolitos. El anillo de retención de nylon (5 mm de DE, 4 mm de DI, 300 μm de espesor) y la malla (4 mm de diámetro, ventana de 2 mm × 1,5 mm, tamaño de poro de 50 μm) se fabricaron a mano con una arandela de nylon (Amazon, B00DHVBPOO) y hoja de nailon tejido (Amazon, CMN-0053-C).

Se modificó un tubo de RMN de 5 mm de diámetro (Wilmad, WG-1000-7) en un tubo de vidrio de 16,5 cm de longitud para que sirviera como cámara de entrada (interior) de gas. Se cortó un agujero (1,5 mm de diámetro) en la parte superior de la tapa del tubo de 5 mm para acomodar la línea de suministro de carbógeno. A continuación, se modificó un tubo de muestra de RMN de 10 mm (Wilmad, 513-1 PP-7FB) en un tubo de vidrio de 18 cm de largo para formar la cámara de intercambio de gases (exterior). Se cortó un agujero (6 mm de diámetro) en el centro de la tapa del tubo de 10 mm para encajar el conjunto del tubo de 5 mm. Se hicieron dos orificios adicionales (1 mm de diámetro) en la parte superior de la tapa del tubo de 10 mm. Uno sirvió como entrada de la membrana de intercambio mientras que el otro permaneció abierto para ventilar el carbógeno entrante. Se introdujo un tubo de intercambio de silicona (HelixMark, 60-011-03) a través de la tapa superior del tubo de 10 mm, se enrolló firmemente alrededor del tubo anidado de 5 mm dentro del compartimiento de intercambio de gases y se pasó a través de un segundo tapón de tubo NMR de 10 mm ubicado en el oxigenador. base. Esta tapa albergaba una clavija de acetal (20 mm HT, 2 mm de diámetro) en su centro sostenida por uretano. Los tramos externalizados de tubería de intercambio de gases se minimizaron a dos segmentos de 10,0 mm unidos mediante un acoplador de nailon de 1/16" (Eldon James Corp., C0-1 NN) a las líneas de perfusión (Cole-Parmer, S-06418-02) que ofrecen una retención de gas. La línea de perfusión que sale de la parte inferior del oxigenador se acopló directamente a la línea de entrada de la cámara de perfusión. La tapa inferior del tubo de RMN de 10 mm se adjuntó sin uretano como un medio para acceder al interior del dispositivo oxigenador para el reemplazo de la membrana.

Se recogieron las mediciones del porcentaje de oxígeno disuelto del perfundido de aCSF (NaCl 120 mM, NaHCO3 26 mM, KH2PO4 1,5 mM, MgSO4·7 H2O 1,4 mM, CaCl2·2 H2O 2 mM, KCl 3 mM, glucosa 10 mM; osmolalidad = 300 mOsm) usando un medidor de oxígeno (Microelectrodes Inc., OM-4) conectado a una sonda de microelectrodos de volumen limitado (Microelectrodes Inc., MI-730). Se realizaron varios ensayos (n = 6) en los que se tomaron mediciones de oxígeno disuelto del depósito de perfusión que se burbujeó directamente con 95 % de O2, 5 % de carbógeno de CO2 (control positivo) o de la cámara de perfusión durante los ensayos en los que el in-bore El oxigenador se suministró con gases de contenido variable de oxígeno (aire ambiente, 95 %, 60 % y 19 %). Para comparar la función del oxigenador interno con el oxigenador de membrana externo, se realizaron mediciones adicionales (n = 10) en la cámara de perfusión mientras se empleaba el dispositivo oxigenador externo alimentado con gas carbógeno (95 % O2, 5 % CO2) durante la perforación. operación (2 ml/min).

Las lecturas de pH del perfundido de aCSF se evaluaron usando un medidor de pH básico Accumet (Fisher Scientific, AB15) conectado a una sonda de muestra de bajo volumen (Mettler Toledo, 6030-02-BNC). Las mediciones se tomaron en el pozo de perfusión (n = 8) con el equipo de perfusión operativo (2 ml/min) conectado al oxigenador de membrana externo o interno. El depósito de aCSF se burbujeó directamente con gas carbógeno (95% O2, 5% CO2) mientras se suministraba la misma mezcla de gas a los oxigenadores internos y externos. Los resultados de los ocho ensayos se promediaron y las medias de ambos grupos de tratamiento se compararon con el rango de pH fisiológico objetivo (7,3–7,4).

Todas las imágenes se realizaron en un espectrómetro de 600 MHz (Oxford) equipado con gradientes de microimagen (Bruker Biospin; Micro 5). La temperatura de la muestra (23 °C ± <1 °C) se midió continuamente y se mantuvo constante usando un circuito de retroalimentación del termopar a una unidad enfriadora (Bruker, BCU II −80/60) que controla la temperatura del aire que fluye a través del orificio del espectrómetro. Todos los datos se recopilaron utilizando una secuencia de eco de espín ponderada por difusión. La ponderación de la difusión se mantuvo constante en b = 1200 s/mm2: un compromiso que ofrece suficiente sensibilidad a los cambios tisulares, así como una relación señal/ruido adecuada (400–500 SNR típica) en el tiempo de exploración disponible. El análisis de datos se realizó fuera de línea utilizando una caja de herramientas estadísticas (Microsoft Excel) y Matlab®. Se recopilaron catorce escaneos consecutivos de eco de espín ponderados por difusión (TR/TE = 2000/11,64 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrópicos, duración = 1,5 h, Promedio = 42) para comparar la señal estabilidad en el tiempo (21 h en total). Se empleó calce manual para asegurar condiciones de campo homogéneas28. Los ajustes de las cuñas se evaluaron utilizando medidas de ancho de línea a la mitad de la altura del pico de la señal del agua, generalmente ≤35 Hz, que se observaron tanto en presencia como en ausencia del oxigenador interno: es decir, el uso del dispositivo no indujo faltas de homogeneidad detectables en el campo. Se emplearon protocolos de imagen idénticos en cada uno de los dos grupos experimentales: una serie con perfusión continua (2 ml/min) y una serie sin perfusión (control estable). Las lecturas de la señal de difusión sin procesar, obtenidas como intensidad de señal promedio en una región de interés, de las tres imágenes tomadas en cada uno de los catorce puntos de tiempo se promediaron y trazaron como una función del tiempo para evaluar la variabilidad de la señal dentro del grupo durante el experimento de 21 h. Las comparaciones estadísticas entre los grupos de tratamiento se realizaron mediante pruebas de equivalencia. El rango de equivalencia (+/-9 % de media) se determinó en función del cambio total de la señal dentro del grupo observado en el grupo de control no perfundido, es decir, estático estable, durante el transcurso del estudio. Ambos conjuntos de datos de imágenes para nuestras pruebas de estabilidad se realizaron en corteza de ratón fija (300 μm de espesor) para eliminar los cambios morfológicos de la muestra como posible causa de cualquier cambio en la señal de difusión observado.

Se aislaron cortes corticales agudos (n = 4, 300 μm de grosor) de ratas mediante vibratomo en un baño de LCR a 4 °C con gas continuo (95 % O2, 5 % CO2) antes de introducirlos en la plataforma de microperfusión. Las muestras se aclimataron a 23 °C bajo perfusión continua durante un período de 1 hora antes de la toma de imágenes. Se recopilaron imágenes ponderadas por difusión (TR/TE = 2000/11,6 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrópico) a intervalos de imagen largos y cortos (duración = 1,5 h, Promedio = 42; duración = 4 min, Promedio = 2) con variaciones en las condiciones de perfusión (continuo = exploraciones de 1,5 h con perfusión activada durante todo el transcurso de 21,5 h; intermitente = exploraciones de 1,5 h con perfusión desactivada durante la recopilación de datos pero activada durante intervalos de perfusión de 10 min en el medio; intervalo largo/exploración larga = Exploraciones de 1,5 h con perfusión activada durante la recopilación de datos y desactivada durante los intervalos de 10 minutos entre exploraciones; exploraciones de intervalo largo/corto = exploraciones de 4 min tomadas con perfusión desactivada intercaladas con intervalos de 1,5 h con perfusión activada). Los datos de la corteza no perfundida se generaron con un corte agudo en vivo colocado en la plataforma y se tomaron imágenes (TR/TE = 2000/11,6 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrópico, duración = 1,5 h, Promedio = 42) durante un curso de tiempo de 15,5 h en ausencia de intercambio de líquido perfundido aCSF. De manera similar, se generaron datos de control estables utilizando un segmento fijo durante un período de tiempo de 18,5 h con parámetros de imagen idénticos en ausencia de perfusión. La intensidad de la señal de difusión (unidades arbitrarias) se registró durante un período de tiempo de 15,5 h a 21,5 h, según el grupo experimental.

Se proporcionan esquemas detallados de la modificación de la bobina de superficie micro, el montaje de la plataforma de microperfusión y el dispositivo oxigenador interno (Figs. 1 y 2). También se ilustra un diagrama de bloques del conjunto del equipo con los accesorios del oxigenador interno y externo (Fig. 3).

Esquema despiezado que detalla los componentes individuales de la plataforma de microperfusión.

(a) Pozo de perfusión maquinado a partir de varilla de acetal (volumen de 150 μl, 9,5 mm de DE, 6 mm de LN, 6 mm de DI). El lado abierto (······) está biselado 30° desde la vertical para acomodar el asiento de una junta de silicona. El lado cerrado contiene un canal horizontal (2,5 mm HT × 1 mm D) en el que se asienta una brida de cable de bajo perfil (Thomas & Betts, SF100-18) (no se muestra) para servir como un medio no permanente para sellar la cámara de perfusión. Las líneas de entrada y salida (Cole-Parmer, S-06418-02) entran por la parte superior del pozo de perfusión y se fijan en su lugar con uretano de alta resistencia al pelado aplicado externamente. (b) Junta tórica de silicona (Amazon, ORS-009-25) que sirve como junta hermética a los líquidos entre el pozo de perfusión y el pozo de tejido. Se fija al pozo de perfusión con un sellador de silicona apto para acuarios. (c) Anillo de retención de nailon (5 mm de diámetro exterior, 4 mm de diámetro interior, pared de 0,5 mm, 300 μm de grosor) fabricado a mano a partir de una arandela plana de nailon (Amazon, B00DHVBPOO). El diámetro interno se amplió a 3,97 mm utilizando un punzón de chapa. El espesor se redujo con una lima de metal. Por último, se cortó una muesca (2 mm) en el anillo con un bisturí para permitir la compresión antes de la inserción en el tejido. (d) Se usó nailon tejido (Amazon, CMN-0053-C) con un tamaño de poro de 50 μm en la construcción de la malla de retención. Se cortó un disco circular (4 mm de diámetro) de la lámina y se cortó una ventana (2 mm x 1,5 mm) de la parte central que se superpone a la cara de la bobina. Esta ventana ayudó a la colocación del tejido al permitir una visualización clara de la región de la muestra en contacto con la bobina y evitó que el nailon entrara en el perfil de excitación de la bobina. (e) Se colocan rebanadas de tejido (hipocampo en la imagen) de 300 μm de espesor en contacto directo con la bobina de superficie y se suspenden verticalmente usando el inserto de malla y el anillo de retención. (f) La microbobina de superficie de cuatro vueltas (500 μm de diámetro) se muestra en la parte inferior de la bobina de 5 mm de diámetro. tejido bien. No se muestran los componentes adicionales del conjunto de la bobina (conductores, condensadores, base de plástico, etc.).

Fotografías de la microbobina modificada de 500 μm y esquema detallado del oxigenador interno.

(a) Vista posterior del ensamblaje de la microbobina que ilustra un canal fresado (15 mm LN × 3 mm HT × 4 mm D) flanqueado por espaciadores de nailon (6 mm LN × 4 mm HT × 0,5 mm W) que atrapan un bajo brida para cables de perfil (Thomas & Betts, SF100-18). ( b ) Vista frontal de la microbobina que detalla los surcos bilaterales (, 3 mm HT × 1,5 mm D). Los cortes proporcionaron espacio para la brida para cables utilizada para sellar de manera reversible el pozo de perfusión. (c) Vista superior del ensamblaje de la bobina. Un orificio (2 mm de diámetro × 14 mm de profundidad) acomoda la clavija de soporte de acetal del oxigenador interno. ( d ) Esquema detallado del dispositivo oxigenador interno (tubos de RMN de 5 mm y 10 mm anidados y abiertos; 19 cm de alto x 1 cm de ancho). Después de pasar por una trampa de burbujas en línea, el perfundido de LCR ingresa al oxigenador interno a través de un tubo de silicona altamente permeable a los gases (HelixMark, 60-011-03). Este tubo (), que constituye la membrana de intercambio de gases del dispositivo oxigenador, se ha enrollado herméticamente dentro de los tubos de RMN anidados para maximizar el área superficial sobre la que se produce el intercambio de gases. El gas carbógeno entra a través de un puerto en la parte superior de la tapa del tubo de 5 mm y pasa a la cámara de intercambio de gases (tubo de RMN de 10 mm) a través del fondo abierto del tubo de 5 mm (). La colocación de un respiradero en la parte superior del tubo de 10 mm asegura que el carbógeno pase sobre la membrana enrollada a medida que el gas sale del conjunto del oxigenador. El aCSF saturado de carbógeno sale por la tapa inferior del tubo de 10 mm y entra en la cámara de perfusión. La distancia drásticamente reducida entre el sitio de intercambio de gases y el sitio de perfusión tisular (2 cm en el interior frente a 500 cm en el exterior) explica las propiedades de retención de gases muy mejoradas observadas. El LCR artificial sale de la plataforma a través de una línea de retorno en su camino hacia un depósito de desechos ubicado fuera del espectrómetro. Los extremos de la membrana de silicona () se empalmaron con líneas Tygon® () (Cole-Parmer, S-06418-02) utilizando acopladores de nailon () (Eldon James, C0-1AGHDPE).

Diagramas de bloques de la plataforma de microperfusión en configuraciones de oxigenador dual.

(a) Configuración del oxigenador externo. Líneas de microperfusión excesivamente largas (5 m) (Cole-Parmer, 06508-13) entre el oxigenador externo (45 cm de ancho × 60 cm de alto × 30 cm de profundidad) y la cámara de perfusión conducen a una desgasificación significativa de nuestro perfundido de LCRa antes de encontrar el tejido rebanada. Esta desgasificación fue responsable de las condiciones de bajo oxígeno (pérdida de O2) y alto pH (pérdida de CO2) registradas en la cámara de perfusión con la configuración del oxigenador externo y se encontró a pesar de nuestro uso de líneas de perfusión diseñadas para una alta retención de gas. (b) Configuración del oxigenador interno. El oxigenador de membrana (19 cm de alto × 1 cm de diámetro) y la trampa de burbujas (9 cm de alto × 1 cm de diámetro) del equipo de microperfusión se han rediseñado utilizando exclusivamente materiales compatibles con RM. Además, las dimensiones de estos componentes se han reducido de modo que ahora pueden encajar directamente dentro del estrecho canal del orificio del espectrómetro (3,5 cm de diámetro). Si bien todavía se produce una desgasificación significativa entre el reservorio de aCSF con burbujas de carbógeno y el espectrómetro de imágenes, el dispositivo oxigenador interno reduce drásticamente la longitud de la línea de perfusión entre el punto terminal de intercambio de gases y la muestra de tejido (2,5 cm), preservando así el oxígeno disuelto fisiológicamente relevante y valores de pH.

Se muestra el contenido de oxígeno disuelto medido en aCSF en el pozo de tejido (n = 6) en función de los gases con contenido variable de oxígeno suministrado por el dispositivo oxigenador interno (Fig. 4). El gas atmosférico (20-22 % O2) y tres mezclas de carbógeno (5 % CO2) con concentraciones variables de oxígeno (95 %, 60 %, 19 % O2) equilibraron el nitrógeno en el oxigenador interno. Las lecturas promedio de oxígeno disuelto para los resultados de seis ensayos fueron 23,0 %, 96,2 %, 59,1 % y 19,2 % para el aire ambiente (20–22 %), 95 %, 60 % y 19 % de gases de O2, respectivamente. Los resultados se comparan con los ensayos de control positivo (n = 6) realizados en el depósito de perfusión durante el burbujeo directo de 95 % de O2, 5 % de CO2 gas carbógeno: 95,1 % de O2 medido. Las mediciones repetidas indican un efecto de saturación de gas del 100 % (es decir, el porcentaje de saturación en el pozo de tejido coincide con el porcentaje de contenido de O2 del gas suministrado) cuando se usa el oxigenador interno. Por el contrario, cuando se empleaba el oxigenador externo, el contenido de gas disuelto en el sitio de perfusión tisular no era equivalente al porcentaje de contenido de oxígeno del gas de suministro (Tabla 1). En pruebas repetidas (n = 10), el contenido promedio de oxígeno disuelto en el LCRa en el sitio de perfusión tisular fue del 43,43 % de O2 cuando se empleó un gas de suministro con una concentración de O2 del 95 %. Esto representa una pérdida del 54,3 % de O2 total disuelto que se produce entre el depósito de perfusión (95,54 % de control positivo de O2) y la cámara de perfusión (43,43 % de O2), medido con el oxigenador de membrana externo.

Propiedades del gas oxígeno disuelto (O2) de aCSF en el sitio de perfusión tisular utilizando el oxigenador interno con gases de contenido de oxígeno variable.

Se comparan tres mezclas de gas carbógeno (5 % CO2 + 95 %, 60 %, 19 % O2 balance N2) con un reservorio de LCR expuesto a gas atmosférico (20–22 % O2; 23 % medido) y un control positivo (95% burbujeado directamente). % O2, 5% CO2 carbógeno). En los tres casos, el contenido de oxígeno disuelto medido en el aCSF se acerca al 100 % de saturación de la concentración contenida en la mezcla de gas suministrada. Los datos se presentan como promedios de grupo (n = 6) con barras de error positivas iguales a la desviación estándar calculada.

Se presentan los resultados de múltiples ensayos (n = 8, suministro de gas = 95 % O2, 5 % CO2) que miden el pH en el sitio de perfusión tisular (Tabla 1). Se comparó la lectura de pH promedio en LCR utilizando el dispositivo oxigenador interno (7.32) con la lectura del oxigenador externo (8.13). Solo las lecturas tomadas al emplear el oxigenador interno se encontraban dentro de un rango de pH objetivo elegido por su capacidad para mantener el metabolismo del tejido neural fisiológicamente relevante (7.3–7.4). Los resultados de las mediciones de pH de un reservorio de LCRa burbujeado directamente (control positivo, 7,36) cayeron dentro del rango fisiológico, mientras que los obtenidos de un reservorio de LCRa no tratado (es decir, desgasificado) (control negativo, 8,22) fueron más similares a las lecturas observadas cuando se usa el oxigenador externo. .

La señal de RM ponderada por difusión (unidades arbitrarias) en función del tiempo del experimento (21 h en total) se informa para dos condiciones experimentales: pruebas con perfusión continua (2 ml/min) y pruebas estáticas sin perfusión (control) (Fig. 5 ). La señal promedio de múltiples experimentos (n = 3) se calcula y grafica en 12 puntos de tiempo separados de 1,5 h. Las pruebas estadísticas de equivalencia determinaron que se cumplían los criterios de equivalencia en todos los puntos de tiempo probados. Los datos presentados en los puntos de tiempo de 4,5 y 6,0 h (n = 2) contenían una medición menos que los grupos restantes debido a un mal funcionamiento del hardware que ocurrió durante la recopilación de la tercera serie (Figs. S1 y S2) y, por lo tanto, se excluyó de la prueba estadística. .

Prueba de estabilidad de la señal de RM en cortes corticales de ratón fijos (300 μm) en condiciones de perfusión constante y sin perfusión.

Señal ponderada por difusión (unidades arbitrarias) a lo largo del tiempo (21 h en total) en series de imágenes con control continuo (: 2 ml/min) y estático (: sin flujo de perfusión). Se informa la señal promedio (n = 3) en 12 experimentos de imágenes separados. Una de las tres mediciones en los puntos de tiempo de 4,5 y 6,5 h se excluyó de la tercera serie debido a un mal funcionamiento del hardware que afectó la recolección. Las pruebas estadísticas muestran que las condiciones para la equivalencia entre grupos (rango = variación de la señal a lo largo del tiempo [21 h] exhibida por nuestro grupo de control estático [±9 %]) se cumplieron en los 12 puntos de tiempo evaluados. Los datos se presentan como promedios de grupo con barras de error positivas y negativas iguales a la desviación estándar. Las barras de error se omitieron del grupo de control estático para mayor claridad.

La estabilidad del tejido, como se indica a través de la intensidad de la señal de RM ponderada por difusión, se analizó para todos los conjuntos de datos de cortes en vivo en función del tiempo del experimento (15,5 a 21,5 h) (Fig. 6). La señal informada en cada punto de tiempo es la intensidad de señal media en una gran región de interés (ROI). Para cada muestra, se utilizó el mismo ROI para todos los puntos de tiempo. Para permitir la comparación de la estabilidad de la señal entre las estrategias de perfusión, normalizamos cada serie de datos a la intensidad en su medición inicial (3 h). En esta presentación de datos, el tejido con una perfusión insuficiente mostraría una mayor intensidad de la señal con el tiempo como resultado de la reducción de la difusividad causada por la isquemia. También incluimos la curva de señal del tejido fijado (también normalizado a su intensidad en el punto de tiempo inicial) como una serie de tiempo de referencia de una muestra completamente estable. Los experimentos que utilizan cuatro protocolos de perfusión independientes se comparan con tejido fijo (control estable) y tejido vivo no perfundido (control de metabolitos insuficiente). Como era de esperar, la corteza no perfundida (, Fig. 6a) muestra un aumento abrupto y sostenido en el comportamiento de la señal de difusión. Por el contrario, las medidas de difusión obtenidas de la muestra fijada permanecen relativamente constantes a lo largo del curso de tiempo de 18,5 h (). Las rebanadas corticales vivas perfundidas (Fig. 6a) exhiben diversos grados de cambio de señal de difusión con el más prominente visto en la muestra de corteza perfundida continuamente () después del punto de tiempo de 14 h. En la Fig. 6a, los regímenes de perfusión restantes son: perfusión intermitente (), intervalos de perfusión largos seguidos de exploraciones cortas () e intervalos de perfusión largos seguidos de exploraciones largas (). Consulte la sección de métodos en Live Slice Perfusion para conocer la duración de los intervalos.

Caracterización de cortes corticales vivos y agudos de ratas usando el aparato de microperfusión y oxigenador interno.

Se informa la señal de RM ponderada por difusión (unidades arbitrarias) normalizada a la medición inicial (3 h) en función del tiempo del experimento (15,5 a 21,5 h). (a) Los experimentos que utilizan cuatro protocolos de perfusión independientes se comparan con tejido fijo (control estable) y tejido vivo no perfundido (insuficiencia metabólica). La corteza no perfundida exhibe un aumento abrupto y sostenido en la señal de difusión (3 a 15,5 h) mientras que la muestra fija permanece relativamente constante (3 a 18,5 h). Los cortes corticales agudos sometidos a perfusión exhiben cambios de señal moderados a lo largo del tiempo que son intermedios a los observados en las dos condiciones de control. Clave de ensayos perfundidos (continuo = exploraciones de 1,5 h con perfusión activada durante todo el transcurso de 21,5 h; intermitente = exploraciones de 1,5 h con perfusión desactivada durante la recopilación de datos pero activada durante intervalos de perfusión de 10 min en el medio; intervalo largo/exploración larga = exploraciones de 1,5 h con perfusión encendido durante la recopilación de datos y apagado durante los intervalos de 10 minutos entre escaneos; escaneos de intervalo largo/corto = escaneos de 4 min tomados con perfusión desactivada intercalados con intervalos de 1,5 h con perfusión activada). (b) Al agrupar los datos de los ensayos perfundidos durante su curso de tiempo compartido (3 a 15,5 h), estos cortes exhiben un comportamiento de estabilidad de la señal de difusión similar a los controles de tejido fijo. La señal de RM ponderada por difusión (unidades arbitrarias) normalizada a la medición inicial (3 h) se informa como una función del tiempo. Los datos se informan como medias de grupo (n = 4) con barras de error positivas y negativas iguales al error estándar de la media.

La figura 6b muestra todas estas estrategias de perfusión agrupadas y comparadas con el curso temporal de la señal de un corte agudo no perfundido y una muestra fija. Este gráfico se limita al transcurso del tiempo, incluidas todas las condiciones medidas (3,0 h a 15,5 h; Fig. 5b). Los cortes corticales perfundidos exhiben características de señal de difusión estables similares a los controles de tejido fijo.

En el presente estudio, describimos un sistema de microperfusión y un dispositivo oxigenador recientemente diseñados y fabricados para su uso en estudios de explantes realizados en entornos de campo magnético ultraalto. Estos componentes se diseñaron específicamente para ajustarse a las intensas limitaciones espaciales y materiales impuestas por los equipos de imágenes de RM de alto campo utilizados en estudios celulares y, por lo tanto, poseen características particulares que no están disponibles en ningún equipo de microperfusión comercial existente. Es importante destacar que todos los materiales del equipo son compatibles con el entorno electromagnético (campos estáticos y variables en el tiempo) del experimento de RM, por lo que son seguros de manejar y no interfieren con la calidad de la medición (p. ej., al deteriorar la homogeneidad del campo principal). Además, nuestro dispositivo oxigenador interno exhibió características de saturación de oxígeno disuelto (O2) al 100 % probadas con múltiples concentraciones de oxígeno en gas de suministro de carbógeno premezclado (Fig. 4). Estos resultados indican una pérdida de O2 virtual del 0% en la saturación de gas oxígeno de nuestro aCSF cuando se usa el oxigenador interno y la plataforma de microperfusión. Además, demuestran que la saturación de O2 en el sitio de perfusión tisular se puede controlar con precisión regulando su concentración en la mezcla de gas de suministro. Esta característica aumenta el control del operador al permitir que los investigadores adapten las condiciones experimentales en función de las diferencias en los requisitos metabólicos específicos del tejido, e incluso dependientes de la actividad29,30,31,32. Tal precisión y control en la ubicación de la perfusión del tejido, en este caso, dentro del orificio de un espectrómetro de imágenes, son indispensables para crear estudios científicos reproducibles y bien construidos con preparaciones de muestras ex vivo. Nuestro hallazgo de que más de la mitad (54,3 %) del contenido de O2 disuelto de nuestro aCSF se perdió durante el viaje desde un oxigenador de membrana externo hasta el pozo de tejido (5 m) destaca la necesidad de un desarrollo adicional de hardware específico para RM. El hecho de que tales resultados se obtuvieran incluso cuando se emplearon líneas de perfusión de baja permeabilidad a los gases y alta retención (Cole-Parmer, 06508-13) sugiere que las soluciones de ingeniería simples adaptadas a los equipos de perfusión preexistentes no serán adecuadas para lograr las condiciones experimentales apropiadas en la microscopía de RM ex vivo. estudios.

Aunque el estudio actual no incluyó la cuantificación directa del gas CO2 disuelto como se realizó con oxígeno, las lecturas de pH en nuestro aCSF tamponado con bicarbonato sirvieron como una medida sensible de los efectos del gas. Esto se debe al papel que juega el CO2 suministrado en la formación de iones de carbonato y bicarbonato, y por lo tanto de protones libres, a través de un intermedio de ácido carbónico como parte del sistema de amortiguación de bicarbonato:

Los constituyentes químicos descritos son los mismos que se utilizan de forma natural con el fin de regular el pH fisiológico en los mamíferos a través de procesos metabólicos respiratorios y excretores33,34. Cuando se suministra a medios de perfusión o de cultivo que contienen un tampón de bicarbonato, el CO2 actúa para estabilizar el pH dentro de un rango fisiológicamente aceptable para los tejidos neurales de los mamíferos: 7,3–7,435,36. Esta es la razón por la cual el CO2 se usa de manera ubicua en mezclas de gases de carbógeno (95% O2, 5% CO2) suministradas a sistemas de cultivo de tejidos tamponados con bicarbonato. La adición de CO2 en dicho sistema da como resultado un aumento en el ácido carbónico y, por lo tanto, un aumento en los iones de bicarbonato e hidrógeno en los que este compuesto se disocia, lo que finalmente da como resultado una disminución del pH. Por el contrario, si las condiciones en el medio se vuelven demasiado ácidas, el bicarbonato eliminará el exceso de iones de hidrógeno y se incorporará a las moléculas de agua tras la liberación de CO2, lo que dará como resultado un aumento del pH. El mantenimiento de las condiciones de pH fisiológicamente relevantes en un medio tamponado con bicarbonato depende, por lo tanto, de un suministro constante de gas CO2. La concentración de CO2 presente en las mezclas de carbógenos utilizadas en el estudio actual (5 %) es un estándar industrial conocido por ser suficiente para mantener estas condiciones; sin embargo, cuando se usó como gas de suministro junto con el oxigenador de membrana externo, el pH medido en el sitio de perfusión tisular fue de 8,13: excesivamente alcalino en comparación con nuestro rango de pH objetivo de 7,3–7,4. Estos datos se observaron a pesar de que se mantuvieron las condiciones de pH objetivo en el depósito de aCSF utilizado para suministrar perfundido al equipo (Tabla 1). Nuestras mediciones de pH tomadas con el oxigenador externo junto con nuestro conocimiento de la química del tampón de bicarbonato descrito anteriormente sugirieron que se mantenía un suministro insuficiente de iones de bicarbonato y, por lo tanto, de protones libres en nuestro aCSF en el sitio de perfusión tisular. Dado que este problema no estaba presente en nuestro aCSF aguas arriba del pozo de tejido, pudimos concluir que el cambio no deseado en el pH se desarrolló cuando nuestro perfundido atravesó la longitud de la plataforma de perfusión: específicamente los 5 m de líneas de perfusión que conectan el oxigenador de membrana externo a nuestra cámara de perfusión de tejidos. Por tanto, se determinó que la causa más probable del cambio observado era una disminución de la pCO2 que se producía a lo largo de la distancia prolongada de las líneas de perfusión necesarias para alcanzar el centro del espectrómetro de formación de imágenes. Los resultados de nuestras pruebas de O2 utilizando el oxigenador externo descrito anteriormente (Tabla 1) confirmaron más tarde que una cantidad excesiva de gas disuelto escapaba a través de nuestras líneas de perfusión por procesos de difusión.

Si bien hay una variedad de tampones disponibles, sobre todo los tampones de Good empleados en la mayoría de las investigaciones biológicas37, se ha demostrado que los sistemas de perfusión tamponados sin bicarbonato alteran el potencial de reposo de la membrana de las neuronas del hipocampo38. Por lo tanto, si bien las condiciones de pH fisiológicamente relevantes pueden haberse obtenido más fácilmente al reemplazar el bicarbonato de sodio con un agente tampón alternativo, ciertas consideraciones, incluida la atención a futuros estudios funcionales, nos impidieron emplear dicha solución. Es más, si bien el cambio de tampones puede habernos permitido lograr un pH fisiológicamente relevante al emplear el oxigenador externo, los problemas con la pérdida de gas oxígeno disuelto habrían persistido.

Tras la integración del oxigenador de membrana interno en nuestra plataforma de microperfusión, las lecturas de pH en el pozo de tejido se regularon dentro del rango de pH objetivo (Tabla 1). La distancia entre el sitio final de gasificación del perfundido y la muestra de tejido se redujo en un factor de 250 (5 m frente a 2 cm) después de cambiar los dispositivos oxigenadores (Fig. 3). Tal reducción en la longitud de las líneas de perfusión entre los sitios de intercambio de gases y perfusión tisular evitó la pérdida de CO2 disuelto al disminuir tanto el área de superficie total como el tiempo durante el cual podrían ocurrir estas pérdidas por difusión.

La gran mayoría de los estudios de microscopía de RM ex vivo hasta la fecha han empleado perfusión discontinua como parte de su protocolo de imagen para eliminar los artefactos de flujo que surgen del perfundido en movimiento39,40,41,42,43,44,45,46. Si bien los experimentos de control en estos estudios informaron la estabilidad de la señal de RM utilizando métodos de perfusión intermitente, los estudios metabólicos demostraron que los explantes de tejido se benefician fisiológicamente del recambio continuo de perfusión47,48. Tales resultados no son sorprendentes dado el papel del perfundido tanto en la entrega de nutrientes vitales como en la eliminación de los subproductos tóxicos del metabolismo. En el estudio actual, debido a la poca profundidad de penetración de la bobina de superficie micro y su separación espacial del perfundido debido a la partición del tejido (300 μm, Fig. 1), planteamos la hipótesis de que la perfusión podría mantenerse durante la adquisición de imágenes sin generar artefactos de flujo. . Para probar esto, comparamos las adquisiciones de difusión de la corteza de ratón fija a lo largo del tiempo (21 h) en condiciones de perfusión continua y perfusión estática e inmóvil (Fig. 5). En exploraciones similares ponderadas por difusión de cortes agudos de hipocampo perfundidos realizados dentro de nuestro grupo de investigación, se demostró la estabilidad de la señal durante un intervalo de tiempo de 8 h utilizando un protocolo de perfusión intermitente que proporcionó una perfusión de 5 min a una velocidad de 2 ml/min por cada 1,5 h del tiempo de escaneo49. Los autores informaron una variación de aproximadamente el 8 % en la señal de difusión sin procesar durante el intervalo de 8 h para su grupo de tejido perfundido estable. Este valor está bastante cerca de la variabilidad de la señal de difusión sin procesar del 9% informada en el estudio actual para nuestro grupo de control estático (Fig. 5). Dadas las diferencias entre los dos estudios, en particular el uso de cortes agudos en lugar de fijos, la variación de la señal de difusión sorprendentemente similar observada es más probablemente el resultado de las limitaciones de estabilidad inherentes al hardware de imágenes empleado en lugar de los cambios que ocurren dentro de la muestra de tejido.

En el caso de nuestro experimento de tejido vivo realizado en cortes corticales agudos, la estabilidad de la señal de difusión se mantuvo durante un período de 15,5 h después del momento de la muerte (TOD) y la posterior preparación de la muestra antes de la obtención de imágenes (Fig. 6). Se seleccionaron un espesor de corte (300 μm) y una temperatura de funcionamiento de 23 °C para lograr una tensión de oxígeno suficiente en toda la muestra, mientras que las condiciones de perfusión (95 % de O2 disuelto, 2 ml/min de velocidad de flujo) aseguraron una entrega de metabolitos y una eliminación de desechos eficientes50,51. Por el contrario, el aumento temprano en la intensidad de la señal de difusión observado en el corte vivo no perfundido coincidió con el edema celular provocado por la falla relacionada con el agotamiento de ATP de las bombas iónicas dentro de las membranas plasmáticas de las células del corte52,53. La inflamación del tejido inducida por hipoxia es el mecanismo físico responsable de la disminución de la difusividad dentro del corte que se manifiesta como un aumento en la señal de resonancia magnética ponderada por difusión. Las muestras perfundidas con el oxigenador interno exhibieron mucha más estabilidad de la señal de difusión que el control comprometido con el metabolito, ya que el cambio de la señal de difusión a lo largo del tiempo fue similar al observado en la muestra de tejido fijada. Como era de esperar, la variabilidad entre grupos aumentó en función del tiempo en los datos promediados de nuestras cuatro muestras perfundidas, lo que puede apreciarse por la amplitud creciente del error medido con el tiempo (Fig. 6b). Curiosamente, sin embargo, la muestra perfundida continuamente exhibió, con mucho, el mayor cambio en la señal de difusión a lo largo del tiempo de los cuatro cortes perfundidos, a pesar de la suposición de que este tejido estuvo expuesto a las condiciones metabólicas más favorables (Fig. 6a). Cabe señalar que estos cambios ocurrieron después del punto de tiempo de 14 h: más tarde del período de tiempo de 6 a 12 h durante el cual los cortes agudos son viables para los registros electrofisiológicos y mucho más tarde del límite de 4 h después del cual se han observado neuronas argirófilas comprometidas bajo condiciones similares. mantenimiento fisiológico54. Dichos efectos en la salud de las rebanadas se han relacionado con la exposición a lipopolisacáridos y lipopéptidos presentes en las paredes celulares de las bacterias55. Estas bacterias están presentes en los medios de perfusión y experimentan aumentos logarítmicos en la densidad de población que comienza entre las 6 y las 12 horas de incubación. Afortunadamente, ya se han desarrollado soluciones de ingeniería que prolongan la tasa de proliferación de bacterias en el perfundido de aCSF y, posteriormente, el período de tiempo durante el cual las preparaciones de cortes agudos siguen siendo funcionalmente viables. Usando supresión de temperatura y filtración de luz ultravioleta (UV), investigadores de la Universidad de Western Sydney han fabricado un sistema de perfusión especializado que es capaz de preservar las características electrofisiológicas de cortes agudos durante períodos de 24 a 36 h56. El éxito demostrado de tales técnicas tiene implicaciones inmensas para la recopilación de imágenes de microscopía de RM, que normalmente tardan horas en completarse. La incorporación de un dispositivo de filtro UV aguas arriba del oxigenador interno en la configuración actual, quizás integrado en el mecanismo de trampa de burbujas, tiene el potencial de duplicar o triplicar el período de viabilidad en los estudios de explantes de tejidos.

Esperamos que el diseño de la plataforma actual descrito y probado aquí se emplee en estudios de RM de resolución celular de explantes de tejido vivo, así como para ayudar en el desarrollo futuro de dispositivos de perfusión compatibles con RM.

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Agradecemos a nuestros compañeros colaboradores en UF: S Roper, G Walter, M King, J Lin, L Su, B Vemuri, M Grant, G Peter. Externo: G Stanisz (Universidad de Toronto), L Guay-Woodford (Universidad de Birmingham, Alabama). Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637) y la Fundación Nacional de Ciencias (acuerdo cooperativo No. DMR-1157490) a través del Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético (NHMFL) Imagen de Resonancia Magnética Avanzada y Instalación de espectroscopia (AMRIS) en la UF y el estado de Florida.

Departamento de Neurociencia, Universidad de Florida, Gainesville, Florida, Estados Unidos de América

Jeremy J. Flint y Stephen J. Banda negra

McKnight Brain Institute, Universidad de Florida, Gainesville, Florida, Estados Unidos de América

Jeremy J. Flint, Kannan Menon y Stephen J. Blackband

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Florida, Gainesville, Florida, Estados Unidos de América

yo apoyo a menon

Centro de Neurociencia Integrativa Funcional, Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

brian hansen

Departamento de Radiología, Universidad de Florida, Gainesville, Florida, Estados Unidos de América

Juan Ford

Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, Florida, Estados Unidos de América

Stephen J. banda negra

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JJF, BH y JF diseñaron el prototipo de equipo de microperfusión JJF y BH fabricaron el prototipo de equipo de microperfusión JJF diseñó el prototipo de oxigenador interno JJF y KM fabricaron el prototipo de oxigenador interno JJF y KM realizaron la recopilación de datos BH y JJF realizaron el análisis de datos JJF, BH, JF, KM y SB escribieron y editaron el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Flint, J., Menon, K., Hansen, B. et al. Un sistema de microperfusión y oxigenador interno diseñado para estudios de microscopía de resonancia magnética en explantes de tejido vivo. Informe científico 5, 18095 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18095

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Recibido: 12 Agosto 2015

Aceptado: 06 noviembre 2015

Publicado: 15 diciembre 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18095

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